Strongylus vulgaris – også kendt som hestens blodorm – er en parasit i Strongylidae-familien. Den bliver betragtet som en af de mest patogene nematoder, der inficerer heste (1,2). Dette skyldes dens karakteristiske livscyklus, der involverer migration via blodkarrene fra tarmene til den kraniale krøspulsåre (krøsroden) og de nærtliggende kar, hvor larverne opholder sig tre til fire måneder, inden de vender tilbage til tarmen igen (3). Denne vandring kan medføre betydelig skade på blodkarrene samt trombosedannelse i krøsroden og dens grene (4,5). Dele af disse tromber kan løsnes og danne tromboembolier, der i nogle tilfælde kan blokere blodtilførslen til sektioner af tarmen og give anledning til non-strangulerende intestinale infarkter. Dette er en alvorlig tilstand, der kræver kirurgisk fjernelse af det afficerede tarmsegment (2,6).
Prognosen er reserveret, men afhænger blandt andet af, hvor hurtigt diagnosen stilles og operationen foretages (2,6).
Inden brugen af effektive antiparasitære midler var S. vulgaris udbredt i hele verden med prævalenser på op mod 100 % (7–9). Indførelsen af ivermectin i 1980’erne formodes at have medført et fald i prævalensen af S. vulgaris, hvor man i et svensk studie fra 1990’erne fandt en prævalens på 6,1 % på individniveau (10,11). Ligeledes viste studier fra USA et drastisk fald i prævalensen (12,13).
Grundet stigende bekymring for resistensudvikling blandt parasitter er der flere parasitkontrol-guidelines fra blandt andet USA og Europa, der anbefaler, at man overvåger ormebyrden og kun behandler ved behov (14,15). Allerede i 1999 indførte Danmark – efterfulgt af Sverige i 2007 – lovgivning, som forhindrer rutinemæssig brug af antiparasitære midler. Ifølge denne lovgivning må behandling med antiparasitære midler først igangsættes, når en diagnose er blevet stillet (LOW nr. 1043 af 23/12/1998, 16). Dette menes at have bidraget til en stigning i prævalensen af S. vulgaris (10,17), som i nyere studier er fundet til mellem 5,7 % (2023) og 12,2 % (2012) på individniveau og mellem 33 % (2023) og 64,3 % (2012) på besætningsniveau i Danmark (10,18). I Sverige er prævalensen fundet til at være op mod 28 % (2019) på individniveau (17).
De primære diagnostiske metoder til at påvise S. vulgaris – larvedyrkning og PCR – bygger begge på tilstedeværelsen af S. vulgaris-æg i gødning. Diagnosticering er derfor først mulig, når S. vulgaris-larven har gennemgået sin migration og er tilbage i tarmen igen, seks til syv måneder efter at hesten er blevet inficeret (3,19). Det er derfor ikke muligt ved brug af disse metoder at detektere en S. vulgaris-infektion i det tidlige (præpatente) stadie og dermed heller ikke, før de patologiske forandringer i krøsroden er sket (3).
Billede 1. Colon med et non-strangulerende intestinalt infarkt i flexura pelvina forårsaget af S. vulgaris. FOTO TINA PIHL.
Formålet med dette review er at sammenfatte den tilgængelige viden om diagnostiske metoder til detektion af S. vulgaris ved at fokusere på nøjagtighed, praktisk anvendelighed og klinisk relevans. Ydermere vil studiet undersøge potentielle fremtidige diagnostiske redskaber.
Billede 2. Strongylus vulgaris livscyklus. Hesten optager infektiøse tredje-stadie larver (L3) fra miljøet. Disse trænger gennem tarmvæggen og ind i arterierne, hvor de udvikler sig til fjerde-stadie larver (L4). Larverne migrerer herefter til den kraniale mesenteriske arterie (krøsroden), hvor de opholder sig i 3-4 måneder. Efter videre udvikling vender de tilbage til tarmen som femte-stadie larver (L5) og modnes til voksne orm, som producerer æg, der udskilles til miljøet cirka 6-7 måneder efter infektion (3,5). Æggene udvikles til L1, L2 og til sidst L3, som igen kan inficere en ny vært. Under optimale forhold tager denne udvikling fra æg til L3 10-14 dage. Illustration lavet med Biorender.
Nuværende diagnostiske muligheder
Traditionelt set har man stillet diagnosen S. vulgaris ved hjælp af larvedyrkning fra gødning, da det ikke er muligt at skelne mellem de forskellige strongylidæg ved almindelig ægtælling (20). Princippet bag larvedyrkning er, at gødning blandes med vand og inkuberes i cirka 14 dage, hvorved strongylid-æggene klækker, og arterne kan identificeres ved mikroskopi ud fra deres morfologi. Det er en relativt simpel og billig metode, der kan udføres i mange hestepraksisser. Dog er metoden tidskrævende og bør udføres af trænet personale, da det kræver erfaring at vurdere larverne morfologisk (21).
Et studie, der har undersøgt den diagnostiske nøjagtighed af larvedyrkning, fandt en relativt lav sensitivitet på 73 % og en specificitet på 84 %, med en positiv prædiktiv værdi på 96 %, men en negativ prædiktiv værdi på kun 37 % (22). Dette betyder, at 63 % af de heste, der testes negativt, reelt kan være smittede, hvilket medfører usikkerhed forbundet med et negativt testresultat.
Et studie fra 2006 udarbejdet i Danmark viste, at langt fra alle dyrlægepraksisser brugte larvedyrkning som en del af deres parasitkontrol. I stedet benyttede mange udelukkende ægtælling med en cut-off-værdi for behandling, baseret på antal æg (16). I disse tilfælde bliver en eventuel behandling udelukkende baseret på ægudskillelsen og ikke på tilstedeværelsen af S. vulgaris. Dette udgør en diagnostisk udfordring, da der ikke er en sammenhæng mellem antallet af strongylidæg i gødning og tilstedeværelsen af S. vulgaris (21). Det er derimod muligt at påvise S. vulgaris ved larvedyrkning selv hos heste med et ægtal på 0 (21). Faktisk er det vist, at med stigende ægtal falder den negative prædiktive værdi, hvilket betyder, at larvedyrkning bliver dårligere til at detektere en S. vulgaris-infektion ved høje ægtal (22). Dette kan skyldes, at cyathostomlarver vil dominere billedet ved høje ægtal, og det kan derfor være sværere at identificere S. vulgaris-larver (22).
I 00’erne blev der udviklet en test for S. vulgaris ved brug af kvantitativ PCR (qPCR), som kan identificere S. vulgaris-DNA fra æg i gødning (20). Da qPCR også er baseret på identifikation af æg i gødning, kræver metoden stadig, at æggene udskilles i gødning, og at der skal indsamles gødningsprøver. Gødningsprøverne skal sendes til et laboratorium, hvor æggene isoleres ved flotation efterfulgt af DNA-ekstraktion, og til sidst kan PCR-analysen udføres (19,21). Ved PCR får man typisk resultatet hurtigere end ved larvedyrkning, men det kræver specialiseret udstyr, hvilket gør det dyrere for forbrugeren.
Det indledende qPCR-studie viste, at metoden detekterede flere positive prøver end larvedyrkning, hvilket tydede på en bedre diagnostisk nøjagtighed (20). To studier har senere undersøgt overensstemmelsen mellem qPCR og larvedyrkning og fandt også signifikante forskelle i antal positive tests, baseret på McNemars test (23,24). På baggrund af fundene i de to studier vil qPCR generelt diagnosticere flere positive prøver end larvedyrkning, og er derfor blevet foreslået som den foretrukne metode (23,24). Et andet studie fandt dog – også baseret på McNemars test – ingen signifikant forskel imellem de to metoder (19).
Det skal dog bemærkes, at når disse studier udelukkende har sammenlignet PCR med larvedyrkning og ikke en gold standard test (obduktion), kan man ikke direkte udlede, at PCR har en højere sensitivitet. Det øgede antal positive prøver detekteret ved PCR kan potentielt repræsentere falsk positive resultater frem for en reel bedre detektionsevne.
Sammenblanding af prøver
Det kan virke tillokkende at samle gødning fra flere heste i én prøve for at nedsætte arbejdsbyrden og omkostningerne forbundet med de diagnostiske undersøgelser. Et studie har dog undersøgt effekten af sammenblandede prøver og konkluderet, at mindst 50 % af hestene skal være positive for at opnå tilstrækkelig diagnostisk sikkerhed. Dette gælder både ved anvendelse af PCR og larvedyrkning (25). Ved sammenblanding af prøver med færre positive heste (<50 %) falder den diagnostiske sensitivitet, hvilket medfører flere falsk negative resultater (25). Dog kan det nævnes, at PCR identificerede flere af de sammenblandede prøver som sandt-positive sammenlignet med larvedyrkning, når andelen af positive heste var under 50 % (25).
Det er i denne sammenhæng også værd at bemærke, at hele Baermann-sedimentet blev undersøgt for larvedyrkningerne i dette studie, hvilket ikke er normal praksis. Dette kan have øget sandsynligheden for at detektere larver i dette studie og dermed påvirket estimaterne af den diagnostiske sikkerhed, hvilket kan begrænse overførbarheden af resultaterne til klinisk praksis.
Overordnet kan det konkluderes, at da sensitiviteten af både larvedyrkning og PCR i forvejen er begrænset (20, 21,24), kan yderligere reduktion ved sammenblanding af prøver ikke anbefales.
Serum-antistof ELISA
Som nævnt, er både larvedyrkning og PCR baseret på identifikation af S. vulgaris-æg i gødning (20) og dermed også, at S. vulgaris-larverne har gennemført deres migrationsfase og er tilbage i tarmen efter seks til syv måneders migration (3). I forsøget på at kunne detektere S. vulgaris-infektioner tidligere er en tredje diagnostisk metode blevet udviklet, nemlig en serologisk ELISA-test baseret på påvisning af antistoffer (SvSXP) mod S. vulgaris i serum (26).
ELISA har vist sig at have moderat diagnostisk præcision med en sensitivitet på 73 % og en specificitet på 81%, hvor op mod en femtedel af prøverne vil være falsk negative (26).
Et studie har vist, at heste, der smittes med S. vulgaris, vil blive ELISA-positive 3 til 5 måneder efter, at de er blevet inficeret (27), hvilket betyder, at infektionen potentielt kan detekteres tidligere end ved larvedyrkning og PCR. Studiet blev dog udført på føl, hvilket medfører usikkerhed om, hvorvidt den sene serokonvertering skyldes den unge alder, eller om det antistof, der detekteres med ELISA (SvSXP), er associeret med den senere larve migration (27). Derudover fandt Nielsen et al. (2015), at heste behandlet med ivermectin kan forblive seropositive i op til fem måneder efter behandlingen (28).
Brugen af ELISA anses derfor primært som et overvågnings- og forskningsredskab snarere end et diagnostisk redskab. Dette skyldes både det forsinkede antistofrespons samt, at der ikke findes en kommerciel ELISA-test for S. vulgaris.
Nyere forskning indenfor S. vulgaris diagnostik
Grundet manglende diagnostiske redskaber, der kan diagnosticere S. vulgaris i det tidlige infektionsstadie, har nyere forskning fortsat fokus på at identificere nye diagnostiske metoder. To studier har undersøgt ændringer i hæmostatiske parametre under infektion med S. vulgaris (29,30). Her fandt Pihl et al. (2017) ændringer i blandt andet D-dimer og fibrinogen, som var korreleret med forekomsten af antistoffer mod S. vulgaris (29). De ændringer, der blev observeret, svarer overordnet til det, man ser ved mild aktivering af koagulation, fibrinolyse og inflammation. Dette stemmer overens med de vaskulære skader, der ses ved en S. vulgaris-infektion (3, 29), men som også kan skyldes andre tilstande (30).
I de senere år er der kommet stigende fokus på brugen af microRNA (miRNA) som diagnostiske markører for sygdom. miRNA er små ikke-kodende RNA-sekvenser, der kan regulere, hvilke gener der udtrykkes, ved at påvirke translationen af messengerRNA til protein (31). Inden for human medicin har ændringer i miRNA vist sig at have et diagnostisk potentiale, især inden for neoplasi (32).
Et nyere studie fra vores forskningsgruppe har undersøgt det diagnostiske potentiale af miRNA under en infektion med S. vulgaris og fandt syv miRNA udskilt af hesten, der var forskellige mellem inficerede og ikke-inficerede heste (33). Flere af disse miRNA har tidligere været associeret med immunrespons, inflammation og vaskulær skade (34–36), hvilket også ses ved en infektion med S. vulgaris (3, 5). Udfordringen ved at bruge værts miRNA som biomarkør er dog, at de har begrænset specificitet, eftersom de afspejler generelle processer i dyret, især inflammation, som også forekommer ved andre tilstande.
Vores studier, har også vist, at parasitterne udskiller parasit-specifikke miRNA, hvilket menes at have til formål at påvirke værtens immunrespons (37). Ved brug af small RNA-sekventering er der i plasma fra S. vulgaris-inficerede heste blevet identificeret 138 parasit-relaterede miRNA (38). Det var dog ikke været muligt at finde en signifikant forskel i tilstedeværelsen af disse miRNA mellem S. vulgaris inficerede og ikke-inficerede heste (33). Dette kan skyldes co-infektion med cyathostomer i de ikke-inficerede heste, som er tæt beslægtede med S. vulgaris og derfor måske udtrykker identiske miRNA.
Billede 3: Parasitter udskiller mikroRNA til sin vært via extracellulære vesikler. Formålet formodes blandt andet at være manipulation af værtens immunforsvar som sikrer parasittens overlevelse. Illustrationen er ikke naturtro, men tjener til at visualisere processen. Lavet i Biorender og redigeret med AI.
I samme studie var det desuden ikke muligt at detektere disse parasit-miRNA i plasma ved brug af PCR (33,38), hvilket udgør en væsentlig udfordring, hvis parasitudskilte miRNA skal have et kommercielt diagnostisk potentiale. I et nyere studie med føl, naturligt smittet med S. vulgaris, var det dog muligt at detektere to parasit-miRNA (Svu-Bantam-06-5p og Svu-Mir-71-5p) med PCR (upublicerede data), hvilket kan danne baggrund for videre studier indenfor brug af disse parasit-miRNA som diagnostiske markører for S. vulgaris.
Konklusion
Strongylus vulgaris er udbredt i Danmark og kan have alvorlige konsekvenser for heste. Larvedyrkning, som forsat er den foretrukne diagnostiske metode i Danmark, er tidskrævende og forbundet med lav negativ prædiktiv værdi, hvilket medfører betydelig usikkerhed især ved negative testresultater. PCR er i flere studier foreslået som en mere sensitiv metode, men der er fortsat uenighed i litteraturen, og sammenligninger i forhold til en egentlig gold standard (obduktion) mangler.
Brug af antistofmåling med ELISA kan muligvis lede til tidligere detektion, men metoden har lige som larvedyrkning en moderat sensitivitet og begrænses af manglende kommerciel tilgængelighed og vedvarende seropositivitet efter behandling.
Sammenblanding (pooling) af prøver reducerer den diagnostiske sikkerhed for både larvedyrkning og PCR og bør derfor undgås. Det er samtidig vigtigt at understrege, at et lavt eller nul i ægtal (EPG) ikke udelukker infektion med S. vulgaris, og at også disse heste bør inkluderes i diagnostisk testning.
Dette review understreger, at der fortsat er behov for fokus på udvikling af nye diagnostiske metoder, der kan detektere S. vulgaris i migrationsfasen og som samtidigt har høj diagnostisk sikkerhed og er praktisk anvendelige i klinisk praksis. Indtil da anbefales individuel testning af alle heste – inklusive dem med lavt EPG – mindst én gang årligt og gerne både forår og efterår.
