Antibiotikaresistens hos Escherichia coli fra grise og sammenhæng med antibiotikaforbrug

Escherichia coli er en vigtig kausal bakterie ved både neonatal diarré og fravænningsdiarré hos grise (1,2). Neonatal diarré i første leveuge forårsaget af hæmolytiske E. coli optræder dog nu relativt sjældent i Danmark, formodentlig på grund af vaccination og avlsarbejde, men diarré forårsaget af hæmolytisk E. coli hos pattegrise over en uge gamle og klassisk fravænningsdiarré, som typisk optræder i dagene efter fravænning, ses derimod hyppigt.

Der er naturligvis andre årsager til diarré end E. coli, og diarré forårsaget af E. coli eller andre patogener kan forekomme på flere alderstrin. Det er vigtigt at forstå, at for, at E. coli kan forårsage diarré hos grise, skal bakterien både besidde faktorer, som gør, at den kan hæfte sig fast på slimhinden i jejunum og ileum, og også danne toxiner, som kan påvirke epithelet, således at der opstår en sekretorisk diarré. De enterotoxigene stammer (ETEC), der fremkalder neonatal diarré, besidder oftest F4 (tidligere benævnt k88) fimbrier, men andre adhæsiner, F5 (k99), F6 (987P), F18 eller F41 er også beskrevet, ligesom de oftest producerer varmestabilt enterotoxin, STa. De ETEC-stammer, der forårsager fravænningsdiarré, har i reglen altid fimbrierne F4 eller F18, men kan også have non-fimbrie adhæsiner, »adhesin involved in diffuse adherence« (AIDA) og »attaching and effacing« – intimin positive - (EAE) (enteropatogene E. coli, EPEC) (1,2,3).

Toxinerne, der er involveret i coli-diarré ved fravænning, er i reglen varmestabilt enterotoxin, STa og STb og varmelabilt enterotoxin, LT. Også et enteroaggregativt E. coli varmestabilt enterotoxin, EAST1, er beskrevet (1,2). I enkelte tilfælde er også verotoxin-producerende (shigatoxin-producerende), VT1 og VT2 (Stx1 og Stx2) (VTEC, STEC), stammer forbundet med diarré hos grise, men typisk skyldes dette, at de involverede VTEC-stammer da også besidder diarréfremkaldende toxiner, idet verotoxin/shigatoxin hovedsagelig er forbundet med ødemsyge (4).

ETEC-stammer, som har F4- eller F18-adhæsinerne, er i reglen altid hæmolytiske og tilhører ofte serovar O149, O138 eller O139, men er også beskrevet i O8, O141 og O147 og eventuelt andre serotyper. Stammer, som ikke har F4 eller F18, men andre adhæsiner, F5, F6, F41 eller intimin, er oftest non-hæmolytiske og tilhører andre serovar end de nævnte (1,2).

Den neonatale coli-diarré kan forebygges ved vaccination af søerne, som derefter udskiller antistoffer i mælken. Disse lactogene antistoffer blokerer for adhæsionen af E. coli til slimhinden i grisenes tarm og virker ret effektivt. Derimod kan diarré forårsaget af hæmolytiske E. coli hos lidt ældre pattegrise og fravænningsdiarré ikke forebygges ved passiv immunitet, men der findes nu svækkede levende non-toxigene orale vaccinestammer baseret på F4- og F18-fimbrier.

Givet de mange forskellige pato- og serotyper af E. coli er der stadig behov for vaccineudvikling (3). I mellemtiden må der fokuseres på det forebyggende arbejde, såsom hygiejnetiltag, optimering af fodersammensætning omkring fravænning, og – en stakket stund endnu – ZnO. Når disse tiltag ikke rækker, kan antibiotikabehandling være nødvendig, og her er det selvfølgelig vigtigt at sikre sig, at den bakteriestamme, der forekommer i besætningen, er følsom for det præparat, man vælger. Vi ved, at der kan forekomme flere resistensprofiler, endog inden for samme besætning (5), så vi kan kun opfordre til mere diagnostik i forbindelse med behandling.

¹CLSI M100, 2018 (8), ²CLSI VET08 4th ed., 2018 (9), ³EUCAST (v 8.1 Breakpoint Tables), ⁴EUCAST Epidemiological cut-off values (ECOFFs), ⁵Tian et al. 2019 (10). S: Følsom, I: Intermediær, R: resistent, Ref.: reference til breakpoint data.

Vi viser her den seneste viden om resistensforholdene hos hæmolytiske E. coli fra grise i Danmark, samlet i perioden 2004 – 2019, og vi diskuterer disse fund i relation til forbrug af antibiotika til grise i samme periode. Resultaterne har tidligere delvis været publiceret i et internationalt tidsskrift (6).

Materialer og metoder

Bakterieisolater og dyrkning
I alt 3.467 E. coli-isolater fra danske grise fra perioden 2004-2019 blev inkluderet i undersøgelsen. Isolaterne var fra klinisk materiale indsendt til undersøgelse på Veterinærinstituttet, DTU, eller SEGES Laboratorium for Svinesygdomme, Kjellerup. Bakterieisolaterne blev påvist ved konventionel dyrkning og identificeret ved biokemiske metoder eller MALDI-TOF. Serotypning blev foretaget ved slide-agglutination. Isolaterne fra 2018-2019 er ikke serotypet, men identificeret som F4 eller F18 ved PCR-analyse. Studiet omfatter således fortrinsvis isolater tilhørende serotype O138, O139 eller O149 og fimbrietype F4 eller F18, men andre serotyper er også repræsenteret.

Resistensbestemmelse
Minimum inhibitory concentration (MIC) for et panel af antibiotika blev fastlagt ved broth microdilution (Sensititre, ThermoFisher Scientific) i henhold til anbefalinger fra Clinical and Laboratory Standards Institute (6). Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 29213 og Enterococcus faecium ATCC 29212 blev brugt som kontrolstammer (7,8).

Testede stoffer og range fremgår Figur 1A-1E. Resultaterne er vist som MIC-fordelinger. Kliniske breakpoints fra CLSI blev anvendt, når de fandtes (8,9), og ellers EUCAST humane kliniske breakpoints (EUCAST.org) eller kliniske breakpoints fra andre publikationer (10). For præcis information om de anvendte tolkningskriterier, se Tabel 1. Desuden er der beregnet MIC₅₀ og MIC₉₀, som er den MIC, hvor henholdsvis halvdelen og 90 % af isolaterne ligger under MIC-værdien.

Sammenligning af resistensniveauer mellem serotyper eller år blev udført ved brug af χ²-test, med signifikansniveau p<0.05.

Resultater

Tallene blev aggregeret til at repræsentere henholdsvis perioderne 2004-2007, 2008-2011, 2012-2015, 2016-2017 og 2018-2019 for at opnå mere robuste data.

Isolaterne var generelt følsomme for fluorokinoloner og colistin i alle perioder, hvorimod der blev registreret høj forekomst af resistens over for ampicillin, spectinomycin, streptomycin, sulfonamider og tetracyklin. MIC-fordelinger og procent resistens er vist i Figur 1A-E.

Omkring 7 ud af hver 10 isolater var resistente over for streptomycin, sulfonamider og tetracyklin. I 2017 var to ud af 72 isolater resistente over for cefotaxime. Heraf var den ene resistent overfor ceftiofur og den anden intermediær, hvilket antyder, at cefalosporinresistens forekommer, men på lavt niveau. Resistensen overfor neomycin faldt fra 31,3 % af isolaterne i 2004-2007 til 14,7 % i 2008-2011 og ned til 9,6 % i 2012-2015. I 2016-2017 og 2018-2019 steg forekomsten af neomycinresistens igen til henholdsvis 13,0 % og 17,8 % (Figur 1D-E, Figur 2). Disse ændringer blev også afspejlet i ændringer i MIC₉₀. Resistensen overfor florfenicol steg jævnt og gradvist fra 2,1 % i 2004-2007 op til 18,1 % i 2017 (Figur 1A-E, Figur 2). Denne stigning blev også afspejlet i en stigning i MIC₉₀, men ikke i MIC₅₀. Herefter faldt resistensen overfor florfenikol igen i 2018 og 2019 til trods for et fortsat stigende forbrug. Data fra VetStat vedrørende forbrug af neomycin og florfenicol er vist i Figur 2 sammen med resistensdata delt ud på enkelte år. Der var en tidsmæssig forbindelse mellem forbrug og resistens for disse antibiotika.

En statistisk signifikant stigning i resistens blev observeret for trimethoprim (p<0,001) fra 37 % i 2004-2007 til 55 % i 2017 og også en stigning i MIC50 (Figur 1). I løbet af 2016-2017 steg resistensen overfor nalidixinsyre (et kinolon) til 15,3 %, hvilket er signifikant højere sammenlignet med tal fra 2004-2015, men i 2018-2019 var niveauet faldet igen til 6,4 %. Isolaterne i 2016 og 2017, der var resistente over for nalidixinsyre, havde også forhøjede MIC-værdier for ciprofloxacin (et fluorokinolon), skønt de stadig blev kategoriseret som følsomme. For andre antibiotika forekom der ingen større udvikling i resistens i løbet af observationsperioden – mange liggende på et stabilt højt niveau gennem hele perioden.

Der var forskelle i resistensmønstre mellem E. coli-serovar. Serovar O149 og O138 havde sammenlignelige resistensmønstre, mens O139 var mindre resistent over for de fleste antibiotika, dvs. ampicillin, chloramphenicol, florfenicol, gentamicin, nalidixinsyre, neomycin, sulfonamider, spectinomycin, streptomycin, tetracyklin og trimethoprim (data ikke vist).

Diskussion

Der er dokumenteret en sammenhæng mellem resistens og antibiotikaforbrug i kommensale bakterier fra dyr i Europa (11), og der er nok ingen tvivl om, at denne sammenhæng også gælder globalt og for både kommensaler og patogener. Generelt observeres højere resistensniveauer i virulente, kliniske isolater fra syge grise sammenlignet med isolater fra raske grise, som formodentlig for det meste er kommensale isolater (4), og der er rapporteret om lavere resistensniveauer i E. coli fra økologiske grise sammenlignet med konventionelle (12). Begge observationer afspejler sandsynligvis forskellene i eksponering for antibiotika.

Generelt bruges der verden over et stort spektrum af antibiotika til behandling af grise – og andre dyrearter – herunder også kritisk vigtige stoffer som fluorokinoloner og 3.- og 4.-generations-cefalosporiner. Dette afspejler sig ofte i høje resistensrater over for disse stoffer, som rapporteres fra flere lande (2), og der er ingen tvivl om, at forbruget af antibiotika i griseproduktionen verden over er en vigtig driver for resistensen i bakterier, herunder også de zoonotiske, i fødevaresektoren (13,14).

Vi fandt for flere antibiotika en relativt høj resistensforekomst i de danske E. coli-isolater, med de højeste niveauer for tetracyklin og streptomycin, hvor ca. 70 % af isolaterne udviste resistens. Derudover var forekomsten af resistens meget høj overfor ampicillin, trimethoprim, sulfonamid og spectinomycin, som ofte forekommer sammen (såkaldt co-resistens) og dermed selekteres ved anvendelse af bare et af stofferne (co-selektion). Høje resistensniveauer over for disse antibiotika i patogene isolater af E. coli er også rapporteret af andre forskere fra både Europa og andre verdensdele, hvilket tyder på, at dette er et globalt fænomen (2,15,16). En udbredt forekomst af co-resistens over for disse antimikrobielle stoffer rapporteres også fra overvågning af kommensale E. coli fra mange lande (17). Den høje resistens over for disse antibiotika kan forklares ved en generel hyppig anvendelse af disse stoffer gennem mange år kombineret med co-selektion.

På trods af begrænsningerne i brugen af kinoloner i produktionsdyr, der blev introduceret i 2002, fandt vi resistens over for nalidixinsyre, omend på lave niveauer. Kun få isolater var resistente over for fluorokinoloner, men nalidixinsyreresistente isolater havde forhøjede MIC-værdier for ciprofloxacin, hvilket antyder en mutation i gyrA- eller parC-genet. Hvis der i stedet for kliniske breakpoints var brugt ECOFF til at vurdere disse isolater med forhøjet MIC-værdi overfor enrofloxacin, ville de være blevet bedømt resistente (non-vildtype), men det vurderes altså, at sådanne isolater fortsat vil kunne behandles med enrofloxacin ved den foreskrevne terapeutiske dosering.

Ud fra en One Health-betragtning bør fluorokinoloner ikke bruges til behandling af dyr, så længe der er effektive alternativer. Det samme gælder for 3.- og 4.-generations-cefalosporiner, såsom ceftiofur. Danske producenter har frivilligt afstået fra at bruge disse stoffer, fordi de er så vigtige humant (førstevalg ved livstruende sygdomme som bakteriæmi). Det afspejlede sig i en meget lav forekomst af resistens i de danske E. coli-isolater overfor ceftiofur eller cefotaxime. Resistens overfor 3.- og 4.-generations-cefalosporiner tyder på, at der er tale om ESBL (extended spectrum beta-lactamase) producerende bakterier, men de få isolater med denne type resistens blev ikke verificeret eller undersøgt nærmere. Fremover bør det overvejes at verificere sådanne eventuelle kliniske ESBL-isolater rutinemæssigt, blandt andet for at kunne sammenligne humane isolater med isolater fra dyr. Dette gør man blandt andet i Sverige. Vi ved, at ESBL-producerende bakterier har zoonotisk potentiale, og at infektioner – typisk urinvejsinfektioner eller sepsis – hos mennesker er meget vanskelige eller umulige at behandle, så derfor er ESBL-producerende bakterier uønskede i fødevarer og fødevareproducerende dyr. Det er derfor af stor betydning, at cefalosporinresistensen er holdt på et lavt niveau i Danmark, i modsætning til en række andre lande – herunder europæiske lande - hvor ESBL er udbredt i isolater fra svin (17).

Resistensniveauerne viste sig for de fleste antibiotika at være relativt stabile over tid, men med bemærkelsesværdige undtagelser. For det første steg resistensen overfor florfenicol støt fra 2,1 % i 2004 til 15,3 % i 2016-2017 og 12,3 % i 2018-2019. Denne stigning ser ud til at afspejle ændringer i anvendelsen, stigende fra næsten nul i 2001 til den hidtil højeste anvendelse på 432,3 kg i 2019 (Tabel 2). I 2018 og 2019 blev der dog registreret et mindre fald i resistensen overfor florfenikol til trods for et fortsat stigende forbrug. Der er ikke nogen forklaring på dette, men det kan skyldes en tilfældighed relateret til den givne stikprøve. Florfenicol er ikke registreret til behandling af tarminfektioner hos grise, men bruges mod luftvejsinfektioner, så stigningen i resistens må ses som en konsekvens af enten behandling af disse eller co-selektion.

En anden interessant udvikling fandt sted for neomycin. Tidligere var neomycin meget brugt til behandling af fravænningsdiarré, men neomycin til oral administration blev fjernet fra markedet i 2008, og dette blev efterfulgt af et fald i resistens over for neomycin (Figur 2). Neomycin-forbruget er igen steget, siden et nyt produkt til oral administration blev introduceret på markedet i 2017, og derefter ser det ud til, at resistensen mod neomycin igen øges og nåede 19,8 % i 2019. Denne udvikling er understøttet af begrænsningerne (vægtning i Gul Kort) i brugen af tetracyklin og colistin. Brugen af colistin til grise er næsten helt stoppet fra begyndelsen af 2017 som følge af restriktionerne efter fremkomsten af mcr-1-medieret-resistens over for colistin i mange lande (hidtil dog ikke påvist hos dyr i Danmark). Forekomsten af neomycinresistens er stadig markant lavere end i 2004-2007, og i de kommende år vil vi se, om denne stigning i neomycinresistens er en fortsat tendens.

Generelt var resistensniveauerne betydeligt lavere blandt E. coli-serovar O139-isolater sammenlignet med O149 og O138, hvilket antyder signifikante forskelle mellem serovarer (Tabel 3). Årsagen til denne forskel er i øjeblikket ukendt, men kan måske relateres til forskelle i sygdomsmønstre og derfor behandlingsprocedurer: O149 og O138 forårsager oftest diarré og udsættes derfor i høj grad for den samme perorale behandling, mens O139 kan forårsage ødemsyge, som kan være underlagt andre behandlingsprocedurer, bl.a. vaccination. Smith et al. (16) fandt i en australsk undersøgelse også forskelle mellem serovar, idet serovar O141 signifikant oftere var resistent overfor flere antibiotika end O149. Mange rapporter om antimikrobiel resistens i E. coli fra grise nævner ikke serotypen, og de tager derfor ikke højde for, at der kan være disse forskelle.

Der viser sig at være store forskelle i forekomst af resistens fra land til land eller region til region, hvilket sandsynligvis afspejler forskelle i forbrug. Hendriksen et al. (15) fandt de laveste niveauer af antimikrobiel resistens i E. coli-isolater fra Norge, Sverige og Finland, hvor forbruget er lavt, og høje niveauer i lande som Spanien, Portugal og Belgien, hvor forbruget er højt. Disse forfattere fandt lav resistens over for ciprofloxacin med bemærkelsesværdige undtagelser for Spanien og Portugal. Nylige data fra Sverige viste også, at den højeste resistens var mod ampicillin, streptomycin, sulfonamider, trimethoprim og tetracyklin (oftest co-resistens) i isolater fra diagnostiske indsendelser (serotype ikke angivet), skønt i lavere niveauer end i Danmark (18).

Smith et al. (16) fandt i deres australske undersøgelse ingen resistens overfor fluoroquinoloner, formodentlig fordi de ikke anvendes til fødevareproducerende dyr i Australien, men heller ikke resistens overfor ceftiofur.

Som nævnt ovenfor har også Polen, Spanien og Italien et højt forbrug af antibiotika, og også her ses der en udbredt resistens hos E. coli fra grise. Således rapporterede Vidal et al. (4) 97,5 % af alle E. coli-isolater fra smågrisediarré multiresistente i et spansk studie. Dette dækker over resistens overfor ampicillin og tetracyklin på næsten 100 %, sulfonamider næsten 90 %, trimethoprim-sulfa på 80 %, enrofloxacin 52 %, ceftiofur 38 %, neomycin 28 % og gentamicin 25 %, alt sammen tal, der ligger væsentligt over de danske. Og i en italiensk undersøgelse fandtes også næsten 100 % resistens overfor tetracyklin og tillige høje resistensniveauer overfor apramycin/gentamicin, trimethoprim-sulfa og enrofloxacin. Generelt sås der også en stigning i resistensen hen over perioden (19).

Frankrig er et af de lande, der har en overvågning af antibiotikaresistens i veterinære patogener. Resultater samles ind fra et netværk af laboratorier over hele Frankrig og samles i en årlig Resapath-rapport (20). Resultaterne for grise fra 2018 ligner forbavsende meget de danske resultater.

Også udenfor Europa er der foretaget studier af resistens hos E. coli fra grise. Generelt ligger resistensniveauerne her over eller væsentligt over de danske. Costa et al. (21) fandt i et brasiliansk studie af E. coli fra grise med diarré resistensniveauer på linje med dem, vi fandt i denne undersøgelse, for bl.a. ampicillin, tetracyklin, sulfonamider og trimethoprim, men til gengæld væsentligt højere resistensniveauer over for stoffer som colistin (28 %), cefalexin (cefalosporin, 44 %), enrofloxacin (30 %) og gentamicin (39 %). Muligvis afspejler dette en større opfindsomhed i valg af præperater (færre restriktioner) hos brasilianske dyrlæger i forhold til danske.

Sammenligning af antibiotikaforbrug mellem lande er vanskelig, idet forbruget oftest opgøres med forskellige metoder og er kun for få lande opgjort med pålidelige tal per dyreart. USA har et antibiotikaforbrug til dyr, som anslået er omkring 7 gange så højt som i Danmark, og i Europa er det kun landene Polen, Ungarn, Spanien, Italien og Cypern, der har et forbrug på samme niveau eller højere end i USA (22,23). Dette afspejler langt lempeligere regler for udskrivning af antibiotika med såkaldt »over the counter«-salg i USA – dvs. uden dyrlægeordination, hvilket er tilladt for ældre antibiotika. Mens sammenligning af antibiotikaforbrug mellem lande er usikker, taler de langt højere resistensniveauer deres tydelige sprog. Således rapporterede Malik et al. (24) i en undersøgelse af 5.072 E. coli-isolater fra amerikanske grise (1995 – 2004) svimlende 97, 99 og 100 % resistens overfor henholdsvis spectinomycin, ampicillin og tetracyklin, men også høje tal for neomycin (66 %), gentamicin (48 %) og ceftiofur (22 %). Bemærkelsesværdigt fandtes ingen resistens overfor enrofloxacin. Som i Danmark sås en stigning i resistensen overfor flere antibiotika hen over perioden 1995 – 2004, men på langt højere niveauer i USA.

Kina er verdens største producent af grise, selvom produktionen er faldet en del de seneste par år på grund af den afrikanske svinepests hærgen. Der findes ikke gode data for forbruget af antibiotika til grise i Kina, men der er grund til at tro, at det ligger særdeles højt, og rapporter om forekomst af resistens er også alarmerende. Således forekommer der rapporter om op mod 100 % resistens overfor tetracykliner og aminopenicilliner og også meget høje resistenstal for mange andre antibiotika, inklusive fluorokinoloner (25,26). Kina er et meget tydeligt eksempel på de meget alvorlige problemer med resistens, som ses i en række lande, hvor antibiotika er anvendt uden nogen form for restriktioner gennem årtier.

Konklusion

De fundne resistensprofiler var relativt stabile med nogle udsving, men generelt uden større ændringer over perioden 2004 til 2019. De vigtigste undtagelser var resistens over for neomycin og florfenicol, med fluktuationer i resistensniveauer med tidsmæssig relation til ændringer i antibiotikaforbruget. Der sås udbredt resistens overfor flere antibiotika, bl.a. tetracykliner, aminopenicilliner og sulfonamider, men resistensen over for fluorokinoloner, cefalosporiner og colistin var meget lav. Resultaterne understreger vigtigheden af diagnostik og resistensbestemmelse for at sikre korrekt og ansvarlig behandling af dyr – og med tanke på forebyggelse af antibiotikaresistens både hos folk og fæ.

Acknowledgements

Teknisk bistand fra medarbejdere ved Veterinærinstituttet og SEGES er højt værdsat. Denne undersøgelse blev støttet med midler fra Fødevarestyrelsen.