Resistensforhold hos danske isolater af Brachyspira hyodysenteriae

8651?.Name Resultaterne af en undersøgelse på isolater af B. hyodysenteriae indsamlet i 2018 viste, at der var resistens over for seks antibiotika. Høje resistensniveauer sås isӕr for tylosin og tiamulin, mens forekomsten af resistensen over for doxycyklin var mindre.

COLOURBOX6602150 © Colourbox
Indblik

Brachyspira hyodysenteriae er kausalt agens for svinedysenteri, en alvorlig tarminfektion med udvikling af typhlocolitis, som oftest optræder klinisk i klimagrise og slagtesvin. Symptomerne er blodig diarre, vægttab og varierende dødelighed (1).

Bakterien er obligat anaerob og er vanskelig at dyrke, hvilket vanskeliggør yderligere laboratorieundersøgelser, herunder resistensbestemmelser. Dette kombineret med, at der hidtil ikke har været nogen officielt anerkendt metode til resistensbestemmelse, er grunden til, at der findes så få undersøgelser af resistensforekomst hos B. hyodysenteriae.

Den taxonomiske status for bakterien har været lidt omtumlet, idet den først blev benævnt Treponema hyodysenteriae, men blev senere kortvarigt omklassificeret som først Serpula hyodysenteriae, dernæst Serpulina hyodysenteriae (2). Der findes andre Brachyspira-arter, som forekommer hos grise, men udover B. hyodysenteriae er det kun B. pilosicoli, der generelt anses for at volde sygdomsproblemer.

Sygdommen forekommer i hele verden, hvor der produceres grise, og er i mange lande endemisk. Den er stærkt tabsvoldende på grund af nedsat tilvækst, øget foderforbrug og dødelighed samt omkostninger til medicin og dyrlæge. I Danmark er svinedysenteri omfattet af SPF-systemet, og sygdommen forekommer sjældent i danske besætninger. Der er dog stadig enkelte besætninger, hvor svinedysenteri forekommer. Her er det essentielt, at det er muligt at behandle effektivt med antibiotika, idet der ikke findes nogen vaccine.

Eftersom der ikke findes nogen nyere data for resistensforhold for danske B. hyodysenteriae-isolater, sker behandling empirisk ud fra forventet følsomhed og effekt. Det samme gælder også for B. pilosicoli, som er væsentlig mere udbredt. Det har vist sig, at der ved infektion med B. pilosicoli hyppigt også er infektion med andre tarmpatogener (3), og dermed kan det være vanskeligt at vurdere, hvorfor en behandling eventuelt ikke har effekt, når man ikke kender resistensforholdene for den/de kausale bakterie(r). Dette kan også være gældende for B. hyodysenteriae. Det er derfor essentielt at tilvejebringe nye data for bakteriens følsomhed i Danmark. Her bringer vi resultaterne af en undersøgelse på isolater af B. hyodysenteriae indsamlet i 2018.

Materialer og metoder

Isolater af B. hyodysenteriae blev isoleret fra tarm- og fæcesprøver indsendt til SEGES Laboratorium for Svinesygdomme i Kjellerup. Kulturer blev herefter sendt til DTU Veterinærinstituttet, hvor de blev subkultiveret for renhedskontrol, hvorefter resistensbestemmelse blev udført. Dette blev gjort ved at fastlægge minimum inhibitory concentration (MIC) overfor doxycyklin, lincomycin, tylosin, tylvalosin, tiamulin og valnemulin (VetMIC Brachy paneler, SVA), som beskrevet i protokollen af Stubberfield et al. (4).

Ved tolkningen af MIC-resultaterne og kategorisering af isolaterne som henholdsvis følsomme eller resistente blev der anvendt tolkningskriterier angivet af Pringle et al. (5). Disse er baseret på MIC-fordelingerne og skelner mellem de oprindelige fuldt følsomme bakterier (vildtype) og bakterier med nedsat følsomhed, dvs. bakterier, der bærer et eller flere resistensgener eller mutationer, som forårsager nedsat følsomhed (non-vildtype). Denne type tolkningskriterier kaldes epidemiologiske tolkningskriterier (ECOFF) og anvendes her, fordi der ikke er fastsat kliniske break-points for B. hyodysenteriae. Det indebærer, at nogle af de bakterier, der her rubriceres som resistente, fordi de har let nedsat følsomhed, muligvis alligevel kan behandles med klinisk effekt af det givne antibiotikum.

Tabel Side 41 (1)

Tabel 1. MIC-fordeling og procent resistente Brachyspira hyodysenteriae (n=18) fra danske grisebesætninger. De vertikale streger angiver ECOFF.

Resultater

Resultaterne for de 18 isolater er vist i tabel 1. Som det fremgår, fandtes der resistens over for alle stofferne, men høje resistensniveauer sås især for tylosin (11/18) og tiamulin (8/18), mens forekomsten af resistensen over for doxycyklin var mindre (2/18). Som det også fremgår, forekom der meget stor variation (range) i MIC-værdierne, som kunne indikere bi- eller trimodale fordelinger, dvs. forekomst af flere forskellige resistensgener eller mutationer med forskellig grad af resistens. Materialet er imidlertid for begrænset til at konkludere alt for meget på det. For tylosin strakte MIC-værdierne sig fx fra 2 μg/ml til >256 μg/ml og for tiamulin fra 0.06 μg/ml til >16 μg/ml.

I besætninger, hvorfra der indgik mere end et enkelt isolat, kunne isolater fra samme besætning have forskellig følsomhed over for et eller flere stoffer. Dette er vist i figur 1. Her fremgår det endvidere, at kun fem isolater var følsomme for alle stoffer. Fra én besætning indgik fem isolater i undersøgelsen. Heraf var et enkelt isolat følsomt for alle stoffer, mens de øvrige var resistente over for lincomycin og tylosin. Fra fire andre besætninger indgik der to isolater pr. besætning. I den ene besætning havde de to isolater samme resistensprofil, mens de i de tre øvrige besætninger adskilte sig fra hinanden for et eller flere stoffer. Således var det ene isolat fra en besætning følsomt for tylosin, det andet resistent. I en anden besætning var det ene isolat følsomt for tiamulin og valnemulin, det andet resistent, og i en tredje besætning var det ene isolat følsomt for alle stoffer, mens det andet var resistent over for tylosin, tylvalosin, valnemulin og lincomycin (Figur 1).

Ingen af isolaterne var resistente over for alle testede stoffer, men et enkelt isolat var resistent for alle undtagen doxycyklin, og her lå MIC-værdien på 0,5 μg/ml, altså kun lige netop under den epidemiologiske cut-off-værdi (ECOFF).

Figur Side 42 (1)

Figur 1. Fordelingen af resistente (R) og følsomme (S) isolater for hver besætning bedømt ud fra ECOFFs.

Diskussion

Der er foreslået ECOFFs for både B. hyodysenteriae og B. pilosicoli ud fra MIC-fordelinger (5). Det er disse ECOFFs, der er anvendt i denne undersøgelse, og det er også dem, der rutinemæssigt anvendes i den svenske resistensovervågning (6). ECOFFs inddeler principielt isolater i vildtype og mutanter (ikke-vildtype), hvorimod klinisk resistens beror på en kombination af MIC-værdier, farmakokinetiske studier og kliniske observationer af terapeutiske doser. MIC-værdier over ECOFFs betyder ikke nødvendigvis, at isolaterne er klinisk resistente – dvs. hvis følsomheden kun er lidt reduceret, kan det valgte antibiotikum alligevel have klinisk effekt. Eksempelvis fandt Pringle et al (5), at 10-15 % af isolaterne var klinisk resistente over for tiamulin, med MIC-værdier over 4. I vores undersøgelse havde 2 ud af 18 isolater en MIC over 4 μg/ml. Andre forskere har foreslået kliniske breakpoints på baggrund af MIC-værdier, farmakokinetiske og kliniske data, men der er forskelle mellem disse forslag (7). Vi kan således ikke med sikkerhed konkludere, at de fundne forhøjede MIC-værdier nødvendigvis vil resultere i behandlingssvigt, men der er grund til at formode, at effekten vil være nedsat i forhold til vildtypen. Det skal i den sammenhæng fremhæves, at B. hyodysenteriae og B. pilosicoli har forskellige MIC-fordelinger (5), hvilket betyder, at man ikke kan forvente samme kliniske effekt på de to arter ved samme dosering.

Der kan opfordres til, at diagnostik af svinedysenteri følges op med en resistensbestemmelse for at opnå en optimal behandling. Forekomsten af mere end én resistensprofil inden for samme besætning kan eventuelt betyde, at der må resistensbestemmes mere end et enkelt isolat.

Resistensbestemmelse af Brachyspira foretages ikke længere i Danmark, men isolater kan i givet fald sendes til et udenlandsk laboratorium, såsom SVA i Uppsala.

Til behandling af svinedysenteri er der i mange lande blandt andet blevet brugt tiamulin, tylosin, lincomycin, virginiamycin, bacitracin og carbadox (7,8). Flere af disse stoffer har også tidligere været anvendt som vækstfremmere, og dette kan være en mulig forklaring på udbredt resistensforekomst, som vedligeholdes af fortsat klinisk anvendelse (9). Det er en generel opfattelse, at der i de fleste lande ses en trend hen imod lavere følsomhed hos B. hyodysenteriae over for vigtige stoffer som tiamulin og valnemulin (pleuromutiliner) og tylosin og tylvalosin (makrolider) og andre. Stammer med nedsat følsomhed for alle stofferne tiamulin, lincomycin, tylosin, tylvalosin og doxycyklin samtidig er rapporteret fra Holland, Tjekkiet, Italien og Australien, men optræder sandsynligvis i flere andre lande også, hvilket kan få stor betydning for behandlingsmulighederne (7,10).

Nedsat følsomhed overfor tylosin og tylvalosin skyldes mutationer i 23S ribosomalt RNA-gener, hvorved bindingen af tylosin inhiberes (11,12). Generelt er der også en sammenhæng mellem MIC-værdier for makrolider og for lincomycin (5), ligesom lincomycin-resistens kan være forbundet med tilstedeværelsen af lnu(C)-genet, som koder for et enzym, der inaktiverer lincosamider (13). I undersøgelsen her fandtes 11 af de 18 isolater resistente over for tylosin, men det skal nævnes, at tilsvarende høje – eller højere – tal er rapporteret fra flere andre lande (7). I Sverige er der set en nedgang i tylosin-resistens fra 81 % i 2005-2006 til 52 % i 2017-2019 (6). Det skal nævnes, at Sverige var det første land til at udfase vækstfremmere, herunder tylosin. Hvorvidt dette kan have været medvirkende til, at de aktuelle svenske resistens-tal for tylosin er faldet over årene, er dog uvist.

Resistens hos B. hyodysenteriae over for tetracykliner kan skyldes en mutation i 16S rRNA-genet (14), hvorimod tet-resistensgener, som hyppigt forekommer hos andre bakteriearter, ikke er beskrevet. Vi fandt, at to af de 18 isolater var resistente over for doxycyklin. Resistensforekomsten kan eventuelt skyldes brugen af tetracykliner til behandling af forskellige infektionssygdomme. I Sverige, hvor brugen af tetracyklin i mange år har været langt lavere end i Danmark, er der i perioden 2012-2019 ikke fundet nogen doxycyklin-resistente B. hyodysenteriae (6).

Nedsat følsomhed for pleuromutiliner skyldes punktmutationer i V-domænet af 23S rRNA-genet og/eller i det ribosomale protein L3-gen (15,16). Endvidere er der påvist et gen, tva(A), som ganske vist ikke selv forårsager klinisk resistens, men fører til reduceret følsomhed ved tilstedeværelsen af de nævnte kromosomale mutationer (17). Også for pleuromutiliner synes der i mange lande at ske en udvikling hen imod lavere følsomhed (7,10,18). Pleuromutiliner har begrænset human anvendelse, og eftersom der ikke synes at forekomme overførbar resistens eller krydsresistens til andre stoffer, anses pleuromutiliner for at være drug-of-choice til behandling af svinedysenteri. Derfor er den stigende forekomst af stammer med nedsat følsomhed en uheldig omstændighed. I Sverige opstod der en resistent klon, som blev spredt til flere besætninger via handel med grise (19). Man har forsøgt at sanere disse besætninger, og man er faktisk gået så langt som at indlede et forsøg på helt at sanere svinedysenteri ud af svensk griseproduktion. Dette vil have en effekt på både dyrevelfærd og antibiotikaforbrug. Samtidig er der foretaget beregninger på omkostningerne ved en sådan sanering, og en måske overraskende konklusion blev, at det faktisk kunne blive en økonomisk gevinst. Selvfølgelig ville der initialt blive omkostninger til selve saneringen, men når nye søer og grise blev sat ind, ville der til gengæld uden sygdommen være en gevinst på bedre tilvækst, mindre foderforbrug, lavere dødelighed, mindre medicinering, færre dyrlægeomkostninger, mv., så regnestykket alt i alt blev positivt (19). I Danmark er B. pilosicoli væsentlig mere udbredt end B. hyodysenteriae og udgør et større klinisk problem. Vi kan derfor opfordre til, at en tilsvarende undersøgelse af MIC-forholdene foretages for B. pilosicoli.

Acknowledgement

Dette projekt blev finansieret af CoVetLab og Fødevarestyrelsen.