Giardia duodenalis: Et komparativt studie mellem en in-house hurtigtest til brug i klinisk praksis og en reference laboratorietest

Klinisk praksis Den diagnostiske performance og herved sensitiviteten og specificiteten af FASTest® undersøges i sammenligning med referencetesten, IFA, til detektion af G. duodenalis i afføring fra hunde og katte.

Shutterstock 1988560751 © Shutterstock
Type 1

Giardia duodenalis er en enterisk protozo, som smitter ved fækal-oral transmission, hvor cyster udskilt med fæces indtages og herefter excysterer i lumen af tyndtarmen (1,2). G. duodenalis er en af de hyppigst forekommende mavetarm-parasitter hos hunde og katte, og er en almindelig årsag til gastrointestinale lidelser (2,3). På verdensplan herunder i Danmark (4,5) er der en rapporteret prævalens på mellem 2-22 % (1,3). Infektionsrisikoen lader til at være højest blandt unge dyr (6,7), formodentligt som følge af et immaturt immunforsvar.

Det er vigtigt at kunne stille en tidlig og præcis diagnose for G. duodenalis infektion, både veterinært for patienternes helbred, men også folkesundhedsmæssigt, idet protozoen har potentielle zoonotiske egenskaber (8). G. duodenalis infektion hos hunde og katte kan dog være svært at diagnosticere, da der ikke findes associerede patognomoniske tegn, og den kliniske præsentation kan variere fra ingen eller milde til alvorlige akutte og kroniske gastrointestinale tegn (9). En pålidelig diagnostisk test er derfor vigtig.

Flere diagnostiske metoder er i dag tilgængelige til påvisning af G. duodenalis infektion. Giardia cyster i afføringen kan visualiseres ved mikroskopi ved brug af fæces smear, fækal flotation eller ved direkte immunfluorescensmikroskopi (IFA). Tilstedeværelsen af Giardia-specifikke copro-antigener kan detekteres ved brug af immunoassays; enten ELISA eller såkaldte immunokromatografiske hurtigtests, der kan udføres i klinisk praksis. Dertil kan DNA fra cysterne i fæces detekteres ved Polymerase Chain Reaction (PCR) (10).

Uanset den diagnostiske metode er det essentielt at have en så repræsentativ afføringsprøve som muligt, da G. duodenalis cyster udskilles intermitterende (11). Ingen diagnostisk test er i dag endeligt identificeret som værende gold standard for påvisning af G. duodenalis i hunde- og katteafføring.

Flere studier anser imidlertid IFA for at være den mest valide metode på baggrund af en angiveligt højere sensitivitet og specificitet sammenlignet med andre diagnostiske værktøjer (12,13). Det er dog en dyr og tidskrævende metode, der kræver specialiseret laboratorieudstyr, såsom fluoroescensmikroskop og praktisk erfaring (14).

Kommercielt tilgængelige in-house hurtigtests kan variere meget i diagnostisk sensitivitet og specificitet, men er blevet førstevalget i mange danske dyreklinikker på grund af brugervenlighed og tilgængelighed (15,16). En af disse hurtigtests er FASTest® CRYPTO-GIARDIA Strip (FASTest®).

Et Giardia-positivt resultat på FASTest® CRYPTO-GIARDIA Strip.

Formålet med dette studie var at evaluere den diagnostiske performance ved bestemmelse af sensitiviteten og specificiteten af FASTest® med IFA som referencetest for at vurdere hurtigtestens kliniske relevans i diagnosticeringen af giardiasis hos hunde og katte. Endvidere blev forekomster samt aldersfordelingen og associerede kliniske tegn for G. duodenalis-inficerede dyr analyseret.

Materialer og metoder

Studiet blev udført som et prospektivt studie ved Veterinær Diagnostisk Laboratorium, Institut for Klinisk Veterinærmedicin, Københavns Universitet fra februar til juni 2021. Projektet blev foretaget i samarbejde med Veterinær Parasitologi, Institut for Veterinær- og Husdyrvidenskab, Københavns Universitet og Center for Diagnostik, Danmarks Tekniske Universitet.

Afføringsprøver blev indsamlet fra hunde og katte af forskellige aldre, racer, køn, boligforhold og klinisk status i Københavnsområdet. Dyrene var enten (i) klinisk symptomatiske patienter fra Universitetshospitalet for Familiedyr med historik om akut eller kronisk diarré og/eller vomitus, (ii) klinisk raske dyr uden historik om diarré og/eller vomitus, der udgjorde studiets kontrolgruppe, eller (iii) internatkatte med begrænset information om klinisk status og signalement.

Det blev bestræbt at indsamle prøver fra mindst tre på hinanden følgende dage fra hvert individuelle dyr, og at prøverne var opbevaret ifølge anbefalingerne fra producenten af FASTest®, dvs. opsamlet uden endogen og eksogen kontamination såsom blod, mucus, græs og kattegrus og opbevaret i højst 4 timer ved 15-25°C, 4 dage ved 2-8°C eller opbevaret på frost (17).

For at simulere forudsætninger i en almindelig dansk klinisk praksis blev afføringsprøver dog inkluderet på trods af, at de ikke opfyldte alle anbefalingerne for opsamling, opbevaring og antal af prøver.

For hvert dyr inkluderet i studiet, blev information om dyrets signalement, samt karakteristik og varighed af eventuelle gastrointestinale tegn indsamlet via et standardiseret spørgeskema. Ligeledes blev der, hvis muligt, indsamlet information om opsamling samt opbevaringstemperatur og -varighed for hver af prøverne.

Billede2 Giardia

Et Giardia-positivt resultat ved direkte immunfluorescensmikroskopi. Giardia cysterne farves grønne af fluorescensfarve.

Statistik

Resultaterne opnået med FASTest® og IFA blev sammenlignet for at undersøge sensitiviteten og specificiteten af FASTest® i henhold til detektion af G. duodenalis hos studiepopulationen. Sande Giardia-positive dyr blev defineret som dyr, der testede positive på IFA. IFA blev derved brugt som gold standard med en defineret sensitivitet og specificitet på 100 %.

Sensitiviteten og specificiteten for FASTest® blev beregnet i fire grupper: Den samlede studiepopulation, hundepopulationen, kattepopulationen og klinisk symptomatiske patienter.

En sammenligning blev foretaget imellem falsk negative, falsk positive og sandt positive prøver med henblik på at vurdere betydningen af håndtering og opbevaring af afføringsprøverne, herunder antal prøver udtaget, opbevaringstemperatur og -varighed og overfladen hvorfra prøverne blev taget.

Sammenhæng imellem klinisk præsentation og alder blev undersøgt blandt de IFA-positive dyr. Tyndtarmsdiarré blev defineret som diarré karakteriseret ved tilstedeværelse af melæna og/eller uændret defækeringsfrekvens. Tyktarmsdiarré blev defineret som diarré karakteriseret ved tilblanding af mucus, frisk blod og/eller øget defækeringsfrekvens. Varigheden af kliniske tegn blev kategoriseret som: »Akut« defineret som mindre end 48 timer, »Subakut« som »48 timer til 3 uger« og »Kronisk« som mere end 3 uger. Til den statistiske analyse blev vedtaget et signifikansniveau på p<0,05.

Deskriptive analyser for kategoriserede data blev foretaget med Fischer’s exact test. For ikke-kategoriserede data blev normalfordeling udregnet ved brug af D’agostino-Pearson omnibus K2 normalitetstest. En dobbelt-siddet uparret T-test blev brugt til at evaluere forskellen i gennemsnitsalder på IFA-positive og IFA-negative dyr på tværs af hunde- og kattepopulationen.

Resultater

Forekomst, associerede kliniske tegn og aldersfordeling blandt IFA-positive dyr

Det endelige prøvesæt bestod af afføringsprøver fra 63 dyr (25 hunde og 38 katte), hvoraf 29 var individuelle prøver og 34 var sammensatte af 2-6 prøver fra samme dyr. Fordelingen af dyr i forhold til alder, køn, kliniske tegn samt forekomsten af G. duodenalis inden for grupperne (i) klinisk symptomatiske patienter, (ii) kontroldyr og (iii) internatkatte, ses i Tabel 1.

I alt testede 17,5 % (n=11) af dyrene positive for G. duodenalis med IFA, heraf 24 % (6/25) hunde og 13,2 % (5/38) katte. Gennemsnitsalderen for de IFA-positive dyr, for hvem alder var oplyst (n=8), var 3,6 år (4 mdr. til 11 år). Her var gennemsnitsalderen for hunde (n=6) højere end gennemsnitsalderen for katte (n=2) på henholdsvis 3,9 og 2,7 år. IFA-negative dyr var i gennemsnit 4,5 år (3 mdr. til 13 år). I alt var 44,4 % (4/9) af de IFA-positive dyr yngre end 1 år.

Selvom 57,1 % af de IFA-positive dyr var klinisk symptomatiske patienter, blev der ikke fundet nogen signifikant sammenhæng (p=0,95) mellem det at have gastrointestinale tegn og være IFA-positiv. Ligeledes blev der ikke observeret sammenhæng mellem Giardia infektionsstatus og kategoriseringen (tynd- eller tyktarmsdiarré og vomitus) eller varigheden (akut, subakut eller kronisk) af de kliniske tegn (Tabel 1).

Tabel 1. Fordeling af ​​alder, karakteristik og varighed af kliniske tegn hos hunde og katte inden for grupperne; kontroldyr, klinisk symptomatiske patienter på Universitetshospitalet for Familiedyr og internatkatte. Prævalensen af ​​Giardia-positive dyr ved direkte immunfluorescensmikroskopi (DIF) inden for grupperne og kategorierne er vist i de lyseblå kolonner. a: Aldersoplysninger var ikke tilgængelige for syv af internatkattene. b: To klinisk symptomatiske hunde og to klinisk symptomatiske katte viste tegn på både tyktarms- og tyndtarmsdiarré baseret på ejernes svar i spørgeskemaet (tilstedeværelse af slim, frisk blod, melæna og øget afføringsfrekvens). Informationer om karakteristik og varighed af de kliniske tegn var utilgængelige for samtlige ​​internatkatte. 24t er lig med 24 timer, 3u er lig med 3 uger.

Diagnostisk performance af FASTest® CRYPTO-GIARDIA Strip

Ud af den samlede studiepopulation (n=63) var 11 dyr IFA-positive, og 10 dyr var positive på FASTest®. Uoverensstemmelser i FASTest®-testresultater i forhold til IFA-testresultater blev observeret hos fem af dyrene. Tre af dem var positive ved IFA, men negative ved FASTest® og ansås derfor som falsk negative. To var negative ved IFA, men positive ved FASTest® og ansås derfor som falsk positive. Baseret på dette blev sensitivitet og specificitet beregnet for den samlede studiepopulation, hundepopulationen, kattepopulationen og de klinisk symptomatiske patienter (Tabel 2).

Tabel 2. Sensitivitet og specificitet (%) af FASTest® CRYPTO-GIARDIA Strip i henholdsvis den samlede studiepopulation (n=63), hundepopulation (n=25), kattepopulation (n=38) og klinisk symptomatiske patienter (n=22) og dets tilsvarende 95 % Konfidensintervaller (KI) i decimaltal.

Der var ingen sammenfald i de tre kategorier af resultater, falsk negative (n=3), falsk positive (n=2) og sandt positive (n=8), med hensyn til dyreart, klinisk præsentation af dyret eller antallet af indsamlede prøver, den overflade - hvorfra prøverne blev indsamlet, og opbevaringsbetingelser.

Diskussion

Dette er det første studie, der evaluerer den diagnostiske sensitivitet og specificitet af FASTest® CRYPTO-GIARDIA Strips detektion af G. duodenalis i afføring fra hunde og katte. I den samlede studiepopulation fandtes en moderat sensitivitet på 72,7 % og en høj specificitet på 96,2 % sammenlignet med referencetesten IFA. Dette afviger fra den oplyste sensitivitet og specificitet af FASTest® ifølge producenten på henholdsvis 96,4 % og 98,6 % (18).

Forskellen imellem studierne kan skyldes valget af referencetest. Producenten sammenlignende resultater fra FASTest® med resultater, der blev opnået med en anden tilsvarende antigen-detektionsmetode, MegaELISA® GIARDIA (19). At vælge en referencetest med de samme grundlæggende egenskaber som testen, der evalueres, kan generere flere af de samme fejl hos begge tests og kan dermed komme til at overestimere performance hos den test, der evalueres (20).

I nærværende studie på Københavns Universitet udviste FASTest® en høj specificitet i både hunde- og kattepopulationen, såvel som hos de klinisk symptomatiske patienter, med specificiteter på henholdsvis 100 %, 93,9 % og 94,4 %. Testen var væsentligt mere sensitiv blandt de testede katte end hunde, idet andelen af falsk negative resultater var større i hundepopulationen. En forklaring kan være, at tilstedeværelsen af antigen i afføringen fra hundene har været under grænseværdien for detektion.

Den overordnede sensitivitet og specificitet af FASTest® opnået i dette studie var baseret på både klinisk symptomatiske dyr, asymptomatiske kontroldyr og internatkatte. Imidlertid vil den kliniske relevans af et diagnostisk redskab, når testet på dyr både med og uden kliniske tegn ikke være repræsentativt for den population, testen typisk vil bruges på. Blandt de klinisk symptomatiske patienter var sensitiviteten af FASTest® kun 50 %. Dette kan være problematisk, da FASTest® er designet til diagnosticering af klinisk syge dyr i højere grad end screening af asymptomatiske bærere. At fejldiagnosticere et inficeret dyr med diarré og/eller vomitus er til stor gene for både dyret selv og dets ejer, ligesom unødige ressourcer kan blive brugt på videre udredning.

Giardia-infektion kan være selvbegrænsende, men kan også persistere i kronisk infektion, hvis efterladt ubehandlet (2,21). Dertil kommer, at dyret kan udgøre en smitterisiko for andre dyr og potentielt mennesker (8). Med en test med en høj specificitet, vil beslutningen om at behandle et FASTest®-positivt dyr dog generelt være indiceret, da risikoen for falsk positive resultater er minimal.

Når man vælger at udføre FASTest® som en del af den diagnostiske udredning af en hund eller kat med gastrointestinale tegn, skal man derfor huske på, at testen er et bedre værktøj til at bekræfte end afkræfte Giardia-infektion. Det skal tilstræbes at opnå den højest mulige sensitivitet, herunder anmode om flere afføringsprøver samt opsamle og opbevare prøverne korrekt, og udføre FASTest® efter producentens protokol (17).

FASTest® er på den anden side et nemt og billigt værktøj til hurtig analyse i klinikken i sammenligning med mere avancerede diagnostiske metoder såsom IFA, der typisk kræver analyse på et eksternt laboratorium, hvorfor diagnostikken er dyrere og prøvesvartiden længere (15,16).

Selvom det blev tilstræbt, at prøverne blev indsamlet efter anbefalingerne for antal, opbevaring og håndtering som beskrevet i producentens protokol (17), opfyldte kun 13 af 63 prøver med sikkerhed kravene. Imidlertid var der prøver blandt både de sandt positive, falsk negative og falsk positive dyr, der ikke levede op til anbefalingerne og de samme risikofaktorer såsom unikke prøver, kontaminanter i prøver samt opbevaring i længere perioder ved en højere temperatur end anbefalet var repræsenteret i alle tre grupper. Der var altså i dette studie intet, der tydede på, at de prøver, som ikke levede op til anbefalingerne, gav et mindre præcist resultat på FASTest® end de prøver, der blev håndteret korrekt.

I den samlede studiepopulation var 17,5 % (11/63) af dyrene positive for G. duodenalis; 24 % (6/25) hunde og 13,2 % (5/38) katte, hvilket er en højere forekomst, end hvad der tidligere er rapporteret i Danmark (4,5). Større prævalensstudier er dog nødvendige for at klarlægge den egentlige forekomst af Giardia-smitte blandt hunde og katte i Danmark.

I dette studie blev der fundet en højere forekomst blandt kontrolhundene, 30 % (3/10), sammenlignet med de 20 % (3/15) af de klinisk symptomatiske hunde. Der blev ikke fundet nogen signifikant sammenhæng mellem at have gastrointestinale tegn og være positiv for G. duodenalis. Dette indikerer, at mange af de dyr, som er inficeret med G. duodenalis, er asymptomatiske bærere, ligesom det tidligere er beskrevet (6).

Baseret på lokalisationen af Giardia tropozoitter i hovedsageligt duodenum og jejunum (10) var det forventet at se en høj forekomst af tyndtarmsdiarré blandt de G. duodenalis-positive dyr. Overraskende sås der i dette studie ikke ud til at være en sammenhæng mellem typen af kliniske tegn såsom tyndtarms- eller tyktarmsdiarré og vomitus blandt dyrene, der var IFA-positive i forhold til IFA-negative (tabel 1). På samme måde blev der ikke fundet sammenhæng mellem varigheden af de kliniske tegn og det at være positiv for G. duodenalis (tabel 1). Selvom studiet er baseret på en lille populationstørrelse, indikerer fundene, at det kliniske billede af Giardia-infektion hos hunde og katte kan variere meget, som tidligere beskrevet (9,21).

I dette studie blev der ikke fundet signifikant effekt af alder, selvom ung alder generelt anses som en risikofaktor for G. duodenalis-infektion (3,9). På verdensplan er der rapporteret prævalenser på 20,8-56,0 % blandt hunde og katte under et år(6,7), hvilket er analogt til 30,7 % fundet i dette studie

Konklusion

Dette er det første kliniske studie, som evaluerer den diagnostiske performance og herved sensitiviteten og specificiteten af FASTest® i sammenligning med referencetesten, IFA, til detektion af G. duodenalis i afføring fra hunde og katte. Studiet fandt en moderat sensitivitet på 72,7 % og en høj specificitet på 96,2 % i den samlede studiepopulation (n=63). Dette viser, at FASTest® er et brugbart diagnostisk værktøj til at bekræfte G. duodenalis infektion i smådyrspraksis med begrænset adgang til andre diagnostiske metoder.

På trods af testens brugervenlighed og et hurtigt testsvar indikerer den lavere sensitivitet på 50 % blandt de klinisk symptomatiske patienter, at hurtigtesten dog ikke er pålidelig nok som diagnostisk værktøj til at udelukke giardiasis hos dyr med gastrointestinal sygdom. Fundene er kun baseret på en studiepopulation bestående af 63 individer, og større studier baseret på hunde og katte med kliniske tegn forenelige med giardiasis er nødvendige for at evaluere den sande værdi af FASTest®.

Den kliniske præsentation af de Giardia-inficerede dyr i dette studie varierede i en sådan grad, at der ikke kunne påvises sammenhæng mellem de kliniske tegn og et positivt IFA-resultat.

Resultaterne i denne undersøgelse fremhæver behovet for forbedringer af sensitiviteten af FASTest®-detektion af G. duodenalis hos hunde og katte, da effektiv diagnosticering og tidlig behandling af giardiasis er afgørende.

 

Dette studie blev til med økonomisk støtte fra Dansk Kennel Klub og Megacor Diagnostik (Hörbranz, Austria). En særlig tak til Oliviya Fernandes for at bidrage med afføringsprøver til projektet.