Allergentestning hos hund: Overensstemmelse mellem metoder og sæsonvariation

Der er gennem tiden udført mange studier, der sammenligner de forskellige muligheder indenfor allergentestning. Til vores frustration er der sjældent overensstemmelse mellem forskellige tests (1, 2). Der findes endnu ingen publicerede studier, der sammenligner den nye PAX test, med de traditionelle allergentests.

Samtidigt er der meget få studier, som undersøger, hvorvidt tidspunktet for prøveudtagelse har indflydelse på testresultatet (1, 3-6, 37). Der er altså både udfordringer, I at vide, hvornår på året, vi bør udføre allergentestning, samt i at vælge den mest relevante testmetode. 

Der er dermed to formål med dette studie:

1. at sammenligne forskellige typer af allergentestning, herunder den nye PAX test, intradermal test, samt Greer serum test, som tilbydes hos IDEXX.
2. at undersøge, om der er forskel på resultaterne, hvis man udtager allergentests på forskellige tidspunkter på året: under en allergisk opblussen, og efter endt opblussen.

Hypotesen er, at der er forskel på resultaterne afhængigt af både testmetoder og testtidspunkt.

Metode

Studiepopulation

I alt fem hunde, diagnosticeret med canine atopisk dermatitis (CAD), indgik i undersøgelsen. Diagnosen blev stillet på baggrund af anamnese og kliniske symptomer, der stemte overens med CAD, samt efter udelukkelse af andre mulige lidelser (7, 8). Alle hunde havde tydeligt sæsonbetingede symptomer med opblussen i foråret. De inkluderede hunde var af begge køn, mellem 2 og 6 år gamle og kom fra Sjælland. Antiinflammatorisk behandling blev seponeret efter guidelines beskrevet i Olivry, T. og Saridomichelakis, M.N., 2013

Allergen specifik-testning

Alle hunde fik foretaget parrede prøver, udført i hhv. foråret og efteråret. Ved hver runde blev tre diagnostiske test udført: IDT, SAT via Greer-metoden, samt SAT via PAX-metoden. Blodprøverne blev udtaget først. Ved IDT blev ca 0,05 ml af hvert allergen injiceret, og histamin og fysiologisk saltvand fungerede som henholdsvis positiv og negativ kontrol. En reaktion blev betragtet som positiv, hvis hævelsens diameter var større end eller lig med gennemsnittet af de to kontrolreaktioner (19).

Dataanalyse

Da datasættet bestod af binære (positiv/negative) og korrelerede værdier, blev der foretaget parvise sammenligninger af resultaterne fra de tre testmetoder. Allergener blev sammenlignet på slægtsniveau (genus). Sammenfaldet mellem resultaterne blev vurderet både ud fra simpel procentvis overensstemmelse og ved beregning af Cohen’s kappa (κ) for at tage højde for tilfældig overensstemmelse. κ-værdier blev fortolket i henhold til retningslinjerne angivet af McHugh, M.L., 2012. Der blev ikke foretaget styrkeberegning.

Tabel 2. Fortolkning af Cohen’s kappa, McHough, M. L., 2012

Resultater

Sæsonvariation i testresultater

De tre testmetoder udviste en høj grad af overensstemmelse mellem forårs- og efterårsundersøgelserne. Greer demonstrerede den mest konsistente sæsonoverensstemmelse med en enighed på 98,3 % og en Cohens kappa på 0,899, hvilket indikerer en næsten perfekt overensstemmelse. PAX viste ligeledes en stærk overensstemmelse (97,2 % enighed; kappa = 0,706), mens IDT-resultaterne havde en lidt lavere, men stadig stærk, sæsonoverensstemmelse på 93,3 % (kappa = 0,741).

Metodeoverensstemmelse mellem testtyper

Overensstemmelsen mellem IDT og Greer var den laveste af alle sammenligninger (80 % enighed; kappa = 0,375), hvilket svarer til minimal metodemæssig overensstemmelse. Sammenligningen mellem IDT og PAX viste en lidt højere enighed på 87,5 % og en tilsvarende let forbedret kappaværdi på 0,449. Den højeste metodemæssige overensstemmelse blev fundet mellem de to serologiske tests, Greer og PAX, som opnåede 93,3 % enighed og en kappaværdi på 0,557, svarende til en svag overensstemmelse.

Tabel 3. Sæsonmæssig overensstemmelse inden for hver testtype.
IDT = Intradermal test (Artuvetrin ® skin test), Greer = IDEXX Laboratories (Greer® Aller-g-complete®), PAX = Nextmune Laboratorie (Pet Allergy Xplorer ®)

Tabel 4. Overensstemmelse mellem testmetoder.
IDT = Intradermal test (Artuvetrin ® skin test), Greer = IDEXX Laboratories (Greer® Aller-g-complete®), PAX = Nextmune Laboratorie (Pet Allergy Xplorer ®).

Resultaterne af en intradermaltest. Diameter på urticarierne måles. Er urticarierne større end gennemsnittet mellem den positive og negative kontrol betragtes prøven som positiv.

Diskussion

Uenigheder mellem testmetoder

Som forventet var der uoverensstemmelse mellem testmetoder. Uenigheden var størst mellem IDT og Greer-SAT, hvor noget af forklaringen måske findes i, at de to testpaneler var så forskellige, med kun otte allergener tilfælles. Desuden er sammenligning mellem IDT og SAT udfordret af at immunologien bag er forskellig. Ved SAT er det kun IgE, som måles, og for en reaktion på IDT kræves der også et cellulært respons. Imellem forskellige typer af SAT er udfordringen for sammenligning især, at der ikke er enighed om enhed eller cut-off værdier.

Ingen pollenreaktioner blev identificeret på IDT, hverken i foråret, eller i efteråret, som ellers var forventet. En mulig forklaring herpå er, at IDT udføres med allergenekstrakter, hvor fortynding kan medføre risiko for falsk-negative resultater, idet koncentrationen af de klinisk relevante allergene proteiner kan være lav (13). Endvidere er pollenallergenerne i det anvendte IDT testkit i blandinger, med op til fem forskellige pollenekstrakter per blanding. Det kan potentielt nedsætte sensitiviteten, da det relative indhold af hvert allergen må blive lavere. Der foreligger imidlertid fortsat begrænset viden, idet der mangler studier, som har undersøgt betydningen af fortyndingseffekten, når allergenblandinger anvendes frem for enkeltallergener

Cross-reactive carbohydrate determinants

Studiet viste generelt mindre sæsonvariation end forventet. Der forventedes større sæsonoverensstemmelse i resultaterne i IDT end i SAT - men det var lige omvendt. Dette kan skyldes, at IDT har en større intraobserver variation end SAT (21). Det kan også skyldes, at SAT har falsk positive resultater, som går igen trods årstid, og dermed giver mindre sæsonvariation.

En kilde til falsk positive resultater ved SAT, er såkaldte cross-reactive carbohydrate determinants (CCD’s). Det er kulhydratstrukturer, som binder til planteproteiner. Nogle hunde har IgE mod disse kulhydratstrukturer, såkaldt CCD-IgE, og kan derfor potentielt slå ud som sensibiliserede overfor pollen. Men disse CCD-IgE er ikke forbundet med sygdom, da de ikke forårsager mastcelledegranulation (22). Af samme grund vil tilstedeværelsen af CCD-IgE i en hunds serum ikke give anledning til falsk positive ved en IDT, men er kun relevante ved SAT.

Grundet risikoen for IgE mod CCD bruger laboratorierne CCD-IgE-blokeringsmetoder (23). Ved PAX er der inkluderet felter med CCD på hver prøve. Såfremt der detekteres CCD-IgE efter første runde af blokering, bliver endnu en runde kørt, med en anden type CCD-IgE-blokering (12). De to runder CCD-IgE-blokering, samt detektionsfelterne, minimerer risikoen for falsk positive (12).

Husstøvmider

Alle fem hunde havde reaktioner på ikke-sæsonbetingede allergener, altså miderne, trods ejers oplevelse af, at hundene primært har sæsonbetinget kløe. Traditionelt betragtes husstøvmiden som et indendørsallergen, og forventes derfor at give anledning til en ikke-sæsonbetinget kløe (24). Én teori peger dog på, at dele af husstøvmidens livscyklus foregår udendørs (38). I så fald kunne en forårsopblussen, som hundene i dette studie har, netop være forklaret med en sensibilisering over for husstøvmider.

En anden mulig årsag til den hyppige positive reaktion for husstøvmider, kan være krydsreaktion mellem D. Farinae og nematoden Toxocara canis. (25). Dette vil sige, at har et dyr tidligere været inficeret med T. canis, kan der opstå falsk positive resultater overfor D. Farinae-ekstrakter på en allergentest. Dette kan ses både ved IDT og SAT (26).

Pollensæson - et irrelevant begreb?

I enkelte tilfælde sås reaktioner på pollentyper, som endnu ikke burde være i sæson i DK på det første testtidspunkt (april-maj). Det er dog blevet vist flere gange at luftbåren pollen kan transporteres meget langt (27-29), og humant har man vist, at disse pollen kan forblive allergene (30). Dette kan forklare de tidlige pollenreaktioner, og betyde at vi skal til at udvide vores forståelse af 'pollensæson' herhjemme, samt at et regionalt testpanel ikke er relevant. Dog ved man, at ikke kun tilstedeværelsen, men også koncentrationen af pollen i luften har betydning for, om der er reaktion hos sensibiliserede mennesker eller ej (36).

Hos flere af hundene sås reaktioner på pollen i efterårs-testrunden, hvor vi egentlig havde forventet at disse pollen ikke længere var i luften, og derfor at SAT burde være negativ.

Pollental bliver generelt målt i luften, på tage. Men med tid vil pollen falde til jorden, og dette kan potentielt være en mere relevant kilde til allergeneksponering for vores kæledyr. Studier peger på, at det hos hunde i høj grad er den epikutane eksponering for allergener, som fører til kliniske symptomer (31), frem for via inhalation. Der mangler dog viden om stabiliteten af pollenproteinerne, når de ligger på jorden (32). Såfremt de fortsat har et allergent potentiale, kan pollen på jorden muligvis give anledning til både en positiv IgE-måling samt hypersensitivitetsreaktioner, længe efter den såkaldte 'pollensæson'.

Fremtidsperspektiver

Den lave sæsonvariation i dette studie kan således indikere, at gentagen testning inden for et år – enten ved ukendt sæsonvariation i symptomer eller ved flere opblussen årligt – har begrænset indflydelse på testresultaterne. Omvendt kan udeladelsen af blot ét klinisk relevant allergen i sammensætningen af allergen immunterapi (AIT) potentielt have betydning for det enkelte dyr, selvom effekten heraf er minimal i et statistisk perspektiv. Tidligere studier har imidlertid påvist nogenlunde ensartet klinisk effekt af AIT baseret på henholdsvis IDT og SAT (33, 34). Den lave overensstemmelse mellem testmetoderne kan derfor indikere, at AIT’s kliniske effekt i mindre grad afhænger af det specifikke allergenindhold, end tidligere antaget, og i højere grad skyldes en mere generel modulation af immunresponset.

Uenigheden mellem testmetoderne peger igen på behovet for yderligere studier, for at etablere en "gold standard" inden for allergentestning. Uenigheden kan dog også indikere, at der kan være en fordel ved at anvende mere end én testtype, idet IDT og SAT afspejler forskellige dele af den immunologiske proces, der ligger til grund for atopisk dermatitis (1, 10). Der findes umiddelbart ingen studier, der kigger på, om der er bedre effekt af en AIT, baseret på en kombination af resultaterne fra både en IDT og SAT. Dette ville være et interessant projekt til fremtiden, for at undersøge om man på den måde kan få en højere succesrate for AIT, og dermed optimere behandlingen af vores atopiske hunde.

En svaghed i dette studie, og lignende studier (3-6), er den lille populationsstørrelse på kun fem hunde, og dermed også et lavt antal positive resultater at sammenligne mellem sæsoner, hvilket gør risikoen for statistiske fejl stor. Der er ikke udført en power analyse forud for studiet, for at afgøre, hvor stor en population vil være optimal. Et større studie, med flere hunde, men også gerne med hyppigere prøvetagning over et år, ville være interessant. I så fald ville man kunne følge IgE-niveauerne, og på den måde få en idé om halveringstiden af IgE hos hunde, som fortsat ikke er undersøgt. Det vil muligvis kunne afklare, hvornår det er bedst at teste vores sæsonbetingede atopikere.

Konklusion

Dette studie havde til formål dels at sammenligne tre forskellige allergentestmetoder – IDT, Greer-SAT og den nyere PAX-SAT – dels at undersøge, om tidspunktet for prøveudtagelse på året kunne påvirke testresultaterne hos hunde med atopisk dermatitis.

Hos de fem hunde udviste de tre testmetoder høj overensstemmelse mellem forårs- og efterårstestning. Det kan muligvis være udtryk for, at tidspunktet for allergentestning, har begrænset betydning for testresultaterne. Da det kun er baseret på resultater fra fem hunde, er der dog behov for større studier.

Der blev påvist lav overensstemmelse mellem testtyperne. Overensstemmelsen var minimal mellem IDT og Greer og svag mellem de to serologiske tests, Greer og PAX, som også vist i tidligere studier. Der findes altså på nuværende tidspunkt ikke en entydig “gold standard” for allergentestning hos hunde. Resultaterne understøtter derfor, at allergentestning bør tolkes som et supplement til den kliniske vurdering og ikke som et selvstændigt diagnostisk værktøj.

Sponsorering

De to laboratorier, Nextmune og IDEXX, sponsorede serumprøverne.