Mikrobiologiske fund i mink og nedbrydningsprocesser belyser komplekse miljø- og sundhedsrisici

På grund af overførsel mellem mennesker og mink bredte smitten med SARSCoV-2 sig hurtigt inden for og mellem danske minkfarme samt tilhørende lokalområder fra juni til november 2020. Dette resulterede i, at 290 minkfarme blev smittet, svarende til cirka 25 % af alle danske farme. Den 4. november 2020 meddelte regeringen, af hensyn til folkesundheden, at alle mink i landet – cirka 17 millioner dyr – skulle aflives og bortskaffes for at eliminere risikoen for udvikling af nye virusvarianter, der potentielt kunne overføres mellem mink og mennesker.

På grund af en begrænset bortskaffelseskapacitet blev cirka fire millioner mink fra besætninger, der var smittede eller mistænkt smittede, nedgravet i to afgrænsede områder i Vestjylland nær Holstebro og Karup. Ved en politisk aftale blev det senere besluttet, grundet bekymring for forurening af grundvand og vandløb i området omkring gravpladserne, at minkene skulle graves op igen efter et halvt år, da de ifølge en vurdering fra DK-Vet ikke længere ansås at udgøre en smitterisiko. De opgravede kadavere blev derefter bortskaffet ved forbrænding (Figur 1).

Vi gennemførte et projekt for Fødevarestyrelsen med henblik på at generere viden om de processer, der er forbundet med nedgravning og genopgravning af store mængder døde dyr i forhold til Fødevarestyrelsens veterinære beredskabsplan ved udbrud af alvorlige husdyrsygdomme. Specifikt skulle projektet give svar på:
1) Nedbrydningsgraden af minkene, 2) menneskelige risici ved mulig emission af giftige gasser og eksponering for smitstoffer ved genopgravning samt 3) forekomst af SARS-CoV-2 og andre mikrobiologiske agens i de opgravede kadavere.

Det øverste lag bestod af læsket kalk, som udgjorde 10-20 % af den samlede kalk- og minkmasse (Figur 1B), der var dækket af cirka 2 meter jord. Begge gravpladser var omgivet af vildthegn med rævebeskyttelse. Seks grave (G1-G6) blev udvalgt til analyser, tre fra Holstebro og tre fra Karup (Figur 1A).

Nedgravningen fandt sted på Karup-pladsen fra 7. til 27. november 2020 og på Holstebro-pladsen fra 8. til 20. november 2020. Opgravning og prøveudtagning, bortset fra gasanalyser, blev udført fra den 25. til 31. maj 2021 på Holstebro-pladsen og fra den 19. til 28. juni 2021 på Karup-pladsen. Gasanalyserne blev udført før opgravning, 20.-21. maj 2021 på Holstebro-pladsen og 5.-6. juni 2021 på Karup-pladsen.

Jorden i gravene under minkene og de læskede kalklag bestod af det oprindelige kompakte jordlag. Jorden, der dækkede laget med mink og læsket kalk, var blevet udgravet under placeringen af kadaverne og var nu ikke længere kompakt. pH-analyser af det øverste jordlag viste stor variation (pH 5,9 til 12,6) med høje alkaliske værdier i jordprøver med synlig tilblanding af læsket kalk.

Under den indledende nedgravningsproces blev det observeret, at minklaget blev forskudt i gravene, når jorden blev lagt oven på kadaverne på både Holstebro- og Karup-pladsen. For at forhindre denne forskydning blev jord efterfølgende lagt på i successive lag over gravene på begge deponeringssteder. Inden jorden blev placeret oven på minklaget, blev der løbende tilsat kalk, som derefter blev vandet. Derudover blev der i Karup placeret lodrette jordbarrierer af cirka 1 meters højde med 30 meters mellemrum i hver grav for at forhindre længdegående bevægelse af minklaget (Figur 1C).

I løbet af tre uger efter den første nedgravning på Holstebro-pladsen var der flere episoder med forskydning og opbrud af minkkroppe, som hver varede to-tre dage (Figur 1D). Disse opbrud skete gradvist, hvor kadaverne viste tegn på forrådnelse, herunder dårlig lugt, misfarvning af huden og oppustethed. Kadaverne blev efterfølgende fjernet og gendeponeret i et nyt segment på gravpladsen. Denne type overfladeopbrud blev ikke observeret på Karup-pladsen.

På begge deponeringspladser var både sænkning og hævning af jordoverfladen over gravene almindeligt forekommende. På Karup-pladsen sank jorden i midten af gravene, mens jorden langs kanterne og over de lodrette jordbarrierer var hævet. Ved nogle grave på begge pladser blev der løbende frigivet væsker og svovlholdige gasser fra revner og udbrudspletter i jorden i op til tre uger efter nedgravningen. Synlige udbrudsformationer af størknet væske fra minkkroppene, blandet med kalk, blev løbende gendeponeret fra opbrudslokationerne. Flere steder på begge deponeringspladser stammede mindre udbrud af små pladelignende strukturer fra sprækker i jordoverfladen (Figur 1E).

Gasudslip fra deponeringspladserne

På trods af forskydningen af minklaget og de langstrakte revner og sprækker i jorddækket blev der målt meget lave koncentrationer af CH4 (2,0-2,5 ppm) ved overfladen, hvilket er tæt på den atmosfæriske baggrund og indikerer minimal CH4-emission fra minkgravene.

Gaskoncentrationsprofiler i jorddækket viste forhøjede CO2-koncentrationer og reducerede O2-koncentrationer, især i den dybere del af jorddækket. Der blev kun målt lave koncentrationer af CH4 (< 40 ppm-niveau), og gaskoncentrationsprofiler indikerede CH4-oxidation i den nederste del af dækjorden. De forhøjede CO2-emissionsstrømme skyldtes sandsynligvis nedbrydning af minkkroppene.

Samlet set viste gasundersøgelserne overraskende lidt gasproduktion fra minkkadavere og ingen væsentlige emissioner til miljøet fra minkgravene. Gasemissionerne udgjorde således ingen risiko, hverken i form af eksplosionsfare eller luftbåren spredning af smitstoffer og bakteriesporer, og bidrog heller ikke til udledning af drivhusgasser. Gasdannelsen bestod hovedsageligt af CO2 med meget lave koncentrationer af CH4, H2S, NH3 og N2O. Toplaget af læsket kalk reducerede sandsynligvis den mikrobielle nedbrydning betydeligt og bidrog til at konservere minkkadaverne.

Nedbrydningsstatus for de nedgravede mink

Forrådnelsesprocesser af væv foregår i tre trin. Først medfører et brat fald i iltspændingen vævsautolyse og frigivelse af cellulære enzymer. Derefter sker der en vækst af anaerobe bakterier og frigivelse af bakterielle enzymer, som er ansvarlige for hovedparten af vævsdestruktionen. Endelig kan insekter medvirke til vævsnedbrydning, hvilket ikke var tilfældet i vores undersøgelse. Graden af vævsdestruktion afhænger således blandt andet af graden af bakteriel aktivitet.

Nedbrydningen af bløddelsvæv blev vurderet ud fra den såkaldte Bradford-skala og inddelt i fire kategorier: 0 (minimal nedbrydning) til 3 (omfattende nedbrydning) (Figur 2A-C). Den totale score for bløddelsnedbrydningen af hoved, torso og ekstremiteter for individuelle kadavere viste ingen sammenhæng med, hvor kadaverne var placeret i gravene. De fleste kadavere havde en nedbrydningskategoriscore på 2, mens cirka 7 % havde en score på 3.

Hovederne på kadaverne udviste generelt det mest fremskredne henfald, og organerne i brysthulen var mere nedbrudte end organerne i bughulen, sandsynligvis på grund af bakteriel aktivitet fra mundhulen (Figur 2C). Mavesækken var sjældent genkendelig, hvilket formodentlig var et resultat af selvfordøjelse på grund af mavesyre og bakteriel nedbrydning. Derimod var tarmene ofte identificerbare med begrænset nedbrydning af bindevævet, hvilket kan skyldes nedsat vækst af tarmbakterier.

Fra hvert minkkadaver blev der udtaget prøver af huden med subkutant fedtvæv og underliggende muskulatur til histologi. Histologisk undersøgelse af hudblokkene viste, at vævsstrukturerne var relativt velbevarede med klar skelnen mellem epidermis, dermis, subkutis og skeletmuskulatur (Figur 2D).

Figur 2. A) Eksempel på relativt intakte mink med lav Bradford-score, det vil sige begrænset nedbrydning af bløddele. B) Minkkadaver til højre fra figur 2A med åbnet bryst- og bughule. Mellemgulv (m). C) Minkkadaver med mellem Bradford-score. Organerne i brysthulen (hjerte og lunger, markeret med ➞) er mere nedbrudte i forhold til bughuleorganerne. Mellemgulv (m). D) Histologisk foto af hudblok med tydelig opdeling af epidermis (pil), dermis (d), subkutis (s) og muskel (m). Masson Trichrom farvning. E) Detalje fra figur 2D, der viser velbevarede muskelfibre med tydelig tværstribning.

På celleniveau var cellekernerne dog opløste, og det var ikke muligt at identificere omridset af de enkelte celler, bortset fra fedtceller og skeletmuskelfibre. Sammenlignet med bindevæv og epidermis viste muskelfibrene oftere tegn på nedbrydning, dog med stor variation af nedbrydningsgraden. I nogle prøver var muskelfibrene næsten intakte med tydelig tværstribning (Figur 2E), mens andre prøver viste en blanding af intakte og nedbrudte muskelfibre. I nogle prøver var næsten alle fibre komplet nedbrudt.

Varierende grader af mineralisering var til stede i alt væv i hudblokkene, men hovedsageligt i subkutis. Ved den histologiske undersøgelse blev der kun observeret få bakterier i vævet. Minkkadaverne blev begravet i november 2020, og de lave temperaturer hen over vinteren og det tidlige forår har sandsynligvis hæmmet bakterievæksten, hvilket delvist kan forklare det lave antal bakterier i vævet. Da den tilførte kalk kun i ringe grad medførte en øget pH-værdi i minkkadaverne, har koncentrationen af bakterier i kadaverne kun i begrænset omfang være påvirket af kalken.

Mikrobiologisk status for de nedgravede mink

Forskellige vævsprøver blev udtaget fra abdomen (pool af mavesæk, tarme og/eller lever) til mikrobiologiske undersøgelser. For disse prøver varierede pH-værdierne mellem 5,9 til 8,8, hvor de fleste prøver havde en pH-værdi mellem 6 og 7, uafhængigt af kadavernes
placering i gravene. På grund af den store mængde tilført læsket kalk var det forventet, at pH-værdierne i kadaverne ville være stærkt alkaliske. Imidlertid blev der i stedet målt pH-værdier i det neutrale område.

Kadaverin dannes ved mikrobiel decarboxylering af aminosyren lysin og kan påvises ved henfald af væv. Der blev målt kadaverinkoncentrationer fra 235 til 1.004 mg/kg i muskelvæv og fra 28 til 764 mg/kg i vævsprøver fra abdomen, hvilket indikerer nogen grad af proteolytisk aktivitet.

Vores mikrobiologiske analyser af vævsprøver fra abdomen viste primært vegetative celler eller sporer af anaerobe bakterier tilhørende rækken Bacillota, især klostridier (Figur 2). Disse fund blev bekræftet ved mikrobiomanalyser af totalt DNA, hvor andelen af de enkelte bakteriegrupper dog varierede lidt mellem de to analysemetoder.

I modsætning til tarmmikrofloraen hos levende mink viste prøver fra minkkadaverne en højere relativ forekomst af Bacillota og en lavere relativ forekomst af klassen Gammaproteobacteria (fx Escherichia og Proteus spp.). Dette skift i de mikrobielle populationer er sandsynligvis et resultat af den anaerobe nedbrydningsproces.

I alt 12 af 107 svaberprøver fra pharynx eller rektum af minkkadavere fra fire af de seks grave var positive for SARS-CoV-2 RNA ved RT-qPCR. SARSCoV-2 positive kadavere blev fundet i både Holstebro og Karup. På grund af manglende registrering af tidspunktet for nedgravning af de enkelte leverancer af aflivede mink var det ikke muligt at bestemme, hvilke farme minkene oprindeligt kom fra.

Ct-niveauerne målt i prøverne (Ct 28-40) indikerede lave niveauer af viralt SARS-CoV-2 RNA. Et efterfølgende bioassay for virusinfektivitet gav ingen positive resultater, hvilket tyder på fravær af infektiøst SARS-CoV-2 materiale. Desuden viste det sig, at cDNA-fragmenter på 1.000 bp kunne amplificeres ved PCR, mens fragmenter på 2.000 bp ikke kunne. Dette indikerer, at selvom viralt RNA var til stede og kunne påvises i 12 af de 107 svaberprøver, var det delvist nedbrudt. Et enkelt brud i RNA-genomet kan medføre, at virus ikke er infektiøst.

Genomisk materiale fra både Aleutian mink disease virus (AMDV) og minkcoronavirus (MCoV) blev påvist ved RT-qPCR i prøver fra flere minkkadavere. Influenza A-virus blev ikke påvist. AMDV, som tilhører familien Parvoviridae, er kendt for sin ekstreme modstandsdygtighed over for miljøfaktorer, herunder høje temperaturer og kemikalier. Denne stabilitet gør AMDV svær at fjerne fra forurenede materialer og fremmer spredningen inden for og mellem minkfarme. Påvisningen af AMDV-genomisk materiale i kadaverne afspejler sandsynligvis virussets modstandsdygtighed, men det er fortsat uklart, om de analyserede prøver indeholdt infektiøst AMDV-materiale, da dette ikke blev undersøgt.

Minkcoronavirus tilhører underslægten Minacovirus (MCoV) inden for slægten Alphacoronavirus. Ligesom SARS-CoV-2 er MCoV en kappeklædt RNA-virus, hvilket typisk reducerer virussets miljømæssige stabilitet og overlevelse. I denne undersøgelse blev det ikke undersøgt, om det påviste MCoV i minkkadaverne var infektiøst.