CRISPR-teknikken gør det muligt at etablere bedre dyremodeller for cancersygdomme

I vid udstrækning bruger cancerforskere nøgne mus med defekt immunforsvar, når de skal transplantere murine og humane cancerceller. Cellerne bliver placeret lige under huden på musens ryg, hvor de begynder at dele sig og vokse til en synlig tumor, dog uden at være tilbøjelige til at sprede sig til indre organer. Disse implanterede tumor-modeller bliver blandt andet anvendt til forskning i stråleterapi og cytostatika og til forskning i stråleterapi og cytostatika og til forskning i hypoksi inde i tumoren. 

Også transgene teknikker har vundet indpas i cancerforskningen, men er en meget langsommelig proces, da mange gener på en gang skal muteres, før at musene spontant udvikler cancer. Her kommer CRISPR-teknikken ind i billedet som en noget hurtigere teknik til at generere flere skader i genomet på kort tid.

CRISPR-teknikken

CRISPR, der er en forkortelse for Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, koder hos bakterier for en molekylær saks, som de gør brug af ved bekæmpelse af virus, de såkaldte bakteriofager.

CRISPR blev første gang fundet i 1987 hos E. coli-bakterier, men uden at forskerne dengang rigtigt forstod funktionen af disse gentagne DNA-sekvenser i bakteriens genom. Dengang vidste man ikke, at bakterier kunne have et tillært immunforsvar – altså at de ligesom os hvirveldyr kan udvikle immunitet, når de har været inficeret med et virus.

Men den viden ændrede sig radikalt, da det i 2007 lykkedes at forstå funktionen af CRISPR. Det viste sig nemlig, at når en bakterie bliver angrebet af et virus, vil stumper af virus genetiske kode blive indlejret i bakteriens egen DNA. Bakterien opbygger derved en slags forbryderalbum, som den senere kan bruge til at genkende virus med.

CRISPR består som sagt af gentagne DNA-sekvenser, og ind i mellem sekvenserne findes de korte stykker DNA, som er dannet ud fra bakteriofagernes arvemasse. Andre dele af CRISPR-sekvensen koder for en molekylær saks, kaldet Cas9, som er i stand til efterfølgende at klippe virus-DNA-strenge over, hvis samme virus igen skulle inficere cellen.

Dog klipper Cas9-saksen kun, når DNA-strengens basesekvens matcher med et stykke af det indlejrede virus-genom (den såkaldte guide-RNA). Herved sikrer bakterien sig, at den ikke angriber eget DNA, men kun det, der stammer fra de indtrængende virus. I sig selv har denne grundvidenskabelige opdagelse været banebrydende i forståelsen af bakteriers evindelige kamp med bakteriofager. Men CRISPR-teknikken har siden hen også fundet praktisk anvendelse som molekylært værktøj i forskningen.

CRISPR-teknikken til cancermodeller

Lektor, ph.d. Martin Kristian Thomsen fra Aarhus Universitet anvender CRISPR-teknikken i sin forskning til etablering af nye dyremodeller for cancer i mus og grise. Om sin forskning fortæller Martin Thomsen:

- Vi laver komplicerede modeller, der er mere lig, hvad man finder i mennesker. Vi bruger CRISPR til at introducere mutationer i cancer-relaterede gener. Herved kan vi ødelægge genet eller skabe en hyper-mutation, som man kender fra KrasG12D-mutation. Vi kan introducere disse ændringer i voksne mus og i få celler ad gangen, hvilket er forskelligt fra de traditionelle genmodificerede mus. Desuden kan vi mutere flere gener på en gang, og derved skal vi ikke krydse forskellige knockout-muse-stammer med hinanden. Det er således hurtigere at lave forskellige modeller end at lave de traditionelle modeller.

Martin Thomsen har i de senere år skabt en forskergruppe omkring sig, som langt hen ad vejen har udført de samme teknikker hos mus og grise, men med forskellig succes. Mens musene udviklede cancer, er det hidtil ikke lykkedes hos grisene. Dette kan skyldes biologiske forskelle mellem mus og grise, omend det molekylær- teknisk stadig er muligt at anvende CRISPR-teknikken i begge arter.

Som Martin Thomsen selv formulerer det, så har CRISPR-teknikken også sine begrænsninger.

- Det er generelt mere kompliceret at lave specifikke mutationer med CRISPR, såsom KrasG12D-mutation. Dog er det muligt. Generelt ser jeg CRIPSR-teknikken som et stort plus for skabelse af nye dyremodeller, dog kan CRISPR ikke lave alt. Hos Martin Thomsens forsøgsdyr er Cas9-delen af CRISPR indsat i dyrenes genom, og forskerne kan efterfølgende aktivere cellerne ved at introducere guideRNA-stykker via en virus-vektor, kaldet adeno-associated virus (AAV). AAV kendes måske bedst fra den nu skrottede AstraZenica-Covid19-vacciner, som gjorde brug af AAV til at introducere virus-antigenet ind i kroppen.

Martin Thomsen bruger tilsvarende AAV til at introducere guideRNA i cellerne, så Cas9 kan spalte de ønskede gener. Det kan blandt andet ske ved at forsøgsdyrene inhalerer AAV-partikler, for derved at inducere lungecancer, eller injektioner kan skabe cancer i prostata, hjerne eller leveren. 

Sammenlignet med den traditionelle embryonale stamcelleteknik (ES), ser Martin Thomsen mange plusser ved CRISPR-teknikken.

- Den store fordel er tiden, da vi ikke skal lave nye stammer, men kan bruge forskellige CRISPR-guides, som vi leverer med AAV. Dog bruger vi Cas9-positive mus, da dette giver et sikkert system. Hvis vi selv bliver eksponeret til vores AAV, vil det ikke gøre noget, da vi jo mangler Cas9-proteinet. Også fra et 3R-perspektiv er det en fordel, da vi ikke spilder mus ved avlen, men kan bruge alle vores dyr til forsøg.

En af de øvrige åbenlyse fordele ved CRISPR-teknikken er, at den principielt kan udføres på alle dyrearter, mens ES-teknikken kun virker på mus. Om fremtiden for CRISPR-teknikken afslutter Martin Thomsen optimist:

- Jeg tror, at CRISPR vil være meget anvendt fremover. Jeg forventer stor udvikling i præcisionen af CRISPR, således at det bliver muligt at lave meget specifikke mutation. Leveringen af CRISPR til celler og organer vil også blive udviklet meget, da der her er et stort behov.