Antibiotikaresistens hos Streptococcus suis fra grise

Baggrund

Streptococcus suis er en grampositiv, oxidase- og katalase-negativ kok, som let vokser på de fleste rutinemæssigt anvendte dyrkningsmedier i diagnostiske laboratorier. Tidligere kunne identifikationen volde besvær, men med moderne metoder, og hvor mange diagnostiske laboratorier er overgået til MALDI-TOF, er identifikationen både hurtig og sikker.

Streptococcus suis er en af de vigtigste patogene bakterier hos grise. I modsætning til mange andre bakterier er den i stand til at forårsage infektion af mange organer, herunder hjerne, mellemøre, led eller hjerteklapper, ligesom den forårsager septikæmi. Bakterien kendes fra alle områder i verden, hvor der produceres grise, og den findes i de fleste (alle?) besætninger, hvor den er en naturlig beboer i tonsiller og næsehule hos grisene, men kan også findes i tarmkanalen og vagina (1,2).

Der findes mange serotyper af S. suis, lige nu er der beskrevet 35, men de er ikke alle lige patogene for grise. Ofte nævnes serotyperne 2, 1/2, 3, 7 og 9 som de hyppigst optrædende, men dette kan skyldes en højere patogenicitet af disse typer, og at de derfor isoleres hyppigst ved infektion. Således er der forskel på serotypefordelingen afhængigt af, om det er isolater fra infektioner eller fra tonsillerne af raske grise (1,2). Infektioner med S. suis behandles i reglen med antibiotika, men der er også mulighed for forebyggende tiltag i form af en kommerciel vaccine eller en autovaccine, som anvendes i nogle besætninger. Kendskab til resistensforhold og forekommende serotyper er derfor essentielt.

Udover at være patogen for grise har S. suis også en vis zoonotisk betydning. Første gang, bakterien blev beskrevet som årsag til infektion hos mennesker, var faktisk fra Danmark (3), men siden er den også beskrevet fra mange andre lande (4). Det ser ud til, at de fleste humane tilfælde forekommer i Asien, og at omfanget er stigende (5). Man mener, at omfanget er større end rapporteret, idet humane kliniske laboratorier kan være mindre opmærksomme på denne bakterie, så den fejldiagnosticeres som Streptococcus pneumoniae, viridans streptokok, eller enterokok (2). Mennesker smittes oftest ved direkte kontakt med grise, enten levende dyr i stalden eller i forbindelse med slagtning. Det er således især landmænd, dyrlæger og slagtere, der rammes. Men der er også rapporter om oral smitte i forbindelse med indtagelse af rå produkter af grisekød (2). I Vietnam er S. suis således den hyppigste årsag til meningitis hos voksne (6) og i Thailand den næsthyppigste (7). Hos mennesker er serotype 2 den langt hyppigst påviste efterfulgt af serotype 14 (2,5).

Tabel 1. Antibiotika testet, kliniske breakpoints og reference til valgte breakpoints (μg/ml) for Streptococcus suis.

¹CLSI M100, 2018, ²CLSI VET08 4th ed., 2018, ³EUCAST (v 8.1 Breakpoint Tables), ⁴Wisselink et al. (nn). S: Sensitiv, I: Intermediær, R: Resistent, Ref.: Reference til breakpointdata.

I denne undersøgelse har vi opgjort resistensforholdene for S. suis-isolater fra perioden 2004-2019 og undersøgt, om der er sket ændringer i denne periode. Ligeledes har vi opgjort serotyperne fra perioden 2016-2017. Resultaterne har tidligere delvist været publiceret i et internationalt tidsskrift (8).

Materialer og metoder

Bakterieisolater og dyrkning

I alt 1.740 S. suis-isolater fra danske grise fra perioden 2004–2019 blev inkluderet i undersøgelsen. Isolaterne var fra klinisk materiale indsendt til undersøgelse på DTU Veterinærinstituttet eller SEGES Laboratorium for Svinesygdomme i Kjellerup. Bakterieisolaterne blev påvist ved konventionel dyrkning og identificeret ved biokemiske metoder eller MALDI-TOF. Serotypning blev foretaget ved slide-agglutination, omend i begrænset omfang. Der blev således testet med antiserum mod type 1, 2 og 7 i hele perioden, mens type 8 udgik i løbet af 2017. Før 2016 blev der ikke testet for serotype 9. Der blev ikke testet for andre serotyper. Isolater, som ikke reagerede med disse sera, blev angivet som NT – ikke typbare med de anvendte sera.

Resistensbestemmelse

Minimum inhibitory concentration (MIC) for et panel af antibiotika blev fastlagt ved broth microdilution (Sensititre, ThermoFisher Scientific) i henhold til anbefalinger fra Clinical and Laboratory Standards Institute (9). Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 29213 og Enterococcus faecium ATCC 29212 blev brugt som kontrolstammer (9,10). Desuden er der beregnet MIC₅₀ og MIC₉₀, som er den MIC, hvor henholdsvis halvdelen og 90 % af isolaterne ligger under MIC-værdien.

Testede stoffer og range fremgår af Figur 1A-1E. Resultaterne er vist som MIC-fordelinger. Fortolkning af resistensdata for S. suis vanskeliggøres af, at der kun findes epidemiologiske cut-off (ECOFF)-værdi for et enkelt stof, tetracyklin, og der desuden kun findes få officielle kliniske breakpoints. Kliniske breakpoints fra CLSI blev anvendt, når de fandtes (10,11) og ellers EUCAST humane kliniske breakpoints (EUCAST.org) eller kliniske breakpoints fra andre publikationer (12). For præcis information om de anvendte tolkningskriterier se Tabel 1.

Sammenligning af resistensniveauer mellem serotyper blev udført ved brug af χ2-test med signifikansniveau p<0.05.

Resultater

Tallene blev opsummeret på perioderne 2004-2007, 2008-2011, 2012-2015, 2016-2017 og 2018-2019 for at gøre tallene mere overskuelige og robuste for sammenligning.

De hyppigst påviste serotyper i perioden 2016-2017 var 2 og 7 efterfulgt af 9, 1, 1/2 og 8. En del isolater var ikke typbare eller blev ikke typet med de anvendte sera (Figur 2). Isolaterne var oftest fra hjerne, led, lunge, mellemøre og meninges.

MIC-fordelingerne og procent resistente er vist i Figur 1A – 1E. En nogenlunde konstant høj andel af resistente isolater blev set for tetracyklin gennem hele perioden, omkring 75 %.

For erythromycin, tiamulin og trimethoprim blev der observeret en stigende tendens til resistens, mest udtalt for erythromycin med 26,1 % resistente i 2004-2007 stigende til 55,8 % i 2018-2019. Dette afspejlede sig ligeledes i MIC₅₀, som var ≤0,25 μg/ml i 2004-2007, men 8 μg/ml i 2018-2019. Et udpræget bredt interval af MIC-værdier for tiamulin blev registreret, helt fra ≤0,25 μg/ml til >64 μg/ml, med de fleste isolater i området fra 0,5-2 ug / ml, men andelen af isolater med høje MIC-værdier steg over tid. Dette afspejles også i en stigning i både MIC₅₀ og MIC₉₀.

For trimethoprim var stigningen også udtalt fra 1,8 % i 2004-2007 til 22,1 % i 2016-2017, mens MIC90 steg fra ≤1 til 8 μg/ml. Der blev ikke observeret nogen større udvikling for andre stoffer i perioden 2004-2019. Både MIC₅₀ og MIC₉₀ for penicillin var lave, men nogle få isolater havde MIC-værdier, som lå over det kliniske breakpoint. For chloramphenicol, sulfonamider, streptomycin og spectinomycin forekom bimodale MIC-fordelinger, og for tetracyclin, trimethoprim, erythromycin, og tiamulin måske endog trimodale MIC-fordelinger. Disse repræsenterer henholdsvis vildtype og non-vildtype med en eller flere erhvervede resistensmekanismer.

Der var statistisk signifikant forskel på resistens mellem serotyperne (p<0,01). Således var serotype 7 mere resistent overfor erythromycin end serotype 2 og 9, som ikke var signinfikant forskellige. Tilsvarende var serotype 2 mere resistent overfor tetracyklin end serotype 7 og 9, mens der ikke var forskel mellem serotype 7 og 9.

Diskussion

I denne undersøgelse viser vi de nyeste tal for MIC-værdier for S. suis fra dansk griseproduktion og udviklingen over de senere år. Dette er vigtigt både af hensyn til anbefalinger til behandling af infektioner hos grise og for menneskers sundhed på grund af forekomst af potentiel kritisk resistens. De tidsmæssige ændringer i resistens, som vi fandt over for flere antibiotika, viser, at resistensniveauer ikke er statiske, og det er derfor nødvendigt med en kontinuerlig overvågning. En sådan overvågning er i en vis udstrækning påbegyndt i DANMAP-regi, hvor der de senere år har været et afsnit om resistens i veterinære patogener (13).

Resistensundersøgelser og sammenligning med andre studier er vanskeliggjort af flere forhold. Helt basalt savnes der tolkningskriterier for, hvornår en bakterie skal bedømmes resistent, henholdsvis følsom eller intermediær for rigtigt mange bakterie/stofkombinationer, og det gælder også for S. suis. Desuden kan forskellige studier være udført med forskellige metoder (disk diffusion, mikrodilution, E-test), agar og bouillontyper, inokulum, inkubationstid og temperatur. Sammenligninger skal derfor tages med et vist forbehold. Vi har derfor i denne undersøgelse valgt også at vise MIC-fordelingerne, hvilket gør det muligt for læseren at drage egne tolkninger og konklusioner. Det mest korrekte ville givetvist være at tolke ud fra ECOFF-værdier, men for S. suis findes der kun en sådan for tetracyklin. Her er tydeligvis et behov for MIC-studier.

I denne undersøgelse viste cirka 75 % af alle S. suis-isolater sig at være resistente over for tetracyklin og med stigende resistens overfor erythromycin og trimethoprim. For andre stoffer var resistensen lav. I en undersøgelse fra 2002-2004 (14) af S. suis fra svin i forskellige europæiske lande blev den højeste forekomst af resistens i Danmark registreret for tetracyklin (52,2 %) efterfulgt af trimethoprim-sulfa (51,5 %) og erythromycin (29 %). Disse cifre afviger noget fra dem, vi har fundet for de efterfølgende år, blandt andet noget lavere for tetracyklin, men meget højere for trimethoprim-sulfa.

Nogen variation i følsomhedsmønsteret blev observeret mellem de forskellige lande. Generelt blev der fundet en høj forekomst af tetracyklinresistens (48 % til 92 %) i Frankrig, England, Holland, Polen og Portugal. De fleste S. suis-isolater var følsomme over for penicillin. Imidlertid var 8,1 % af de polske og 13 % af de portugisiske isolater resistente over for penicillin. Vi fandt kun få danske isolater resistente overfor penicillin og uden nogen stigende tendens, omend der sås et relativt stort spænd i MIC-værdierne.

Penicillin er et smalspektret antibiotikum og bør i reglen være førstevalg ved behandling af streptokok-infektioner. Derfor er det vigtigt, at resistensforekomsten hos S. suis overfor penicillin forbliver på et lavt niveau. Penicillinresistens blev også rapporteret fra Canada og USA af Sweeney et al. (15), der fandt 16-26,4 % S. suis resistente over for penicillin. Disse forfattere fandt også flertallet af isolater resistente over for tetracyklin og med meget høje MIC-værdier overfor makrolider. Årsagen (genetisk) til de forhøjede MIC-værdier for penicillin er ikke beskrevet, men er blandt andet også set hos Streptococcus uberis, og her er det kædet sammen med mutationer i penicillin-bindende protein gene 1, som kan resultere i en mangefold forøgelse af MIC (16).

Det ser ud til, at MIC₅₀ og MIC₉₀ for tiamulin stiger over tid, hvilket antyder faldende følsomhed af S. suis for tiamulin. Tiamulin er det tredje hyppigst anvendte antimikrobielle lægemiddel til grise efter tetracykliner og makrolider og er generelt brugt til behandling af Brachyspira- og Lawsonia-infektioner. Enhver ændring i følsomhed hos S. suis overfor tiamulin skal derfor sandsynligvis tilskrives selektion på grund af behandling af andre infektioner. Et engelsk studium (17), hvor resistensniveauerne var nogenlunde på niveau med de danske, fandt ligeledes en stigende andel resistente isolater over tid, 2009-2011 sammenlignet med 2013-2014, for flere antibiotika: Aminoglycosider, fluorokinoloner, pleuromutiliner, trimethoprim-sulfa og tetracyklin. Denne undersøgelse dokumenterede også, at kliniske isolater generelt var mere resistente end ikke-kliniske isolater for flere antibiotika (17).

En spansk undersøgelse (18) viste også en meget høj andel resistente isolater overfor tetracykliner, makrolider, lincosamider og sulfonamider, mellem 87 % og 96 %, altså væsentlig højere end i vores undersøgelse, hvilket afspejler et væsentlig højere antibiotikaforbrug. Meget høje resistenstal for tetracykliner, makrolider og lincosamider blev også fundet i et japansk (19) og to kinesiske studier (20,21), ligesom Chen et al. (20) fandt, at de fleste isolater indeholdt indtil flere gener, der kodede for tetracyklin-, makrolid- eller lincosamid-resistens. I en brasiliansk undersøgelse (22) blev der fundet svimlende 97,7 % resistens overfor tetracykliner, men også meget høje resistensniveauer overfor flere andre antibiotika. En anden brasiliansk undersøgelse viste også høje resistensniveauer overfor især tetracyklin, makrolider, lincosamider og sulfonamider (23).

Vi fandt forskelle i resistens mellem serotyper, hvor højest resistens overfor tetracyklin sås hos serotype 2, og højest resistens overfor erythromycin sås hos serotype 7. Serotypemæssige forskelle er også rapporteret af andre forskere. Aarestrup et al. (24) fandt også den samme sammenhæng i danske isolater, mens Vela et al. (18) fandt, at serotype 9 oftere var resistent overfor makrolider og lincosamider end serotype 2.

Vi kan ikke sige, om grunden til, at vi hyppigst fandt serotyperne 1, 2, 7 og 9, er, at de er mest patogene for grise, eller de bare er de mest udbredte. Det kan også delvis skyldes valget af sera til serotypningen, idet gruppen af ikke-typbare isolater kan rumme flere serotyper, som ikke er blevet erkendt. Den stigning, der på verdensplan synes at være sket for serotype 2 over de senere år, kunne dog tyde på, at denne type er mere virulent end andre.

De fleste isolater blev dyrket fra hjerne, led, lunge, mellemøre og meninges, men dette afspejer ikke nødvendigvis den reelle fordeling af patologiske manifestationer, eftersom der i reglen kun bliver foretaget MIC-bestemmelser på et enkelt S. suis-isolat fra samme gris, selvom bakterien påvises i flere organer. Til gengæld viser det bakteriens evne til at forårsage infektioner i flere organer.

Der synes således at forekomme store forskelle i resistensniveauer hos S. suis mellem lande, hvilket formodentlig afspejler forskelle i antibiotikaforbrug. Der er ingen tvivl om, at der findes en sammenhæng mellem forbrug og resistens, omend den ikke altid er direkte (25,26). Under alle omstændigheder er der behov for en tilgang til behandling af S. suis-infektioner hos grise, som afspejler en One Health- og prudent use-tilgang (27). I det ovenfor nævnte brasilianske studium (22) var konklusionen på de høje resistensniveauer, at drug of choice måtte være ceftiofur, altså et 3./4.-generations cefalosporin til en sygdom, hvor mindre kritisk vigtige antibiotika, eventuelt bare simpelt penicillin, måske ville være lige så effektivt. Dette afspejler en helt anden tilgang til håndtering og forståelse af antibiotikaresistens i andre dele af verden – eller måske netop mangel på samme, og man forstår, at kampen mod antibiotikaresistens og -forbrug bliver lang og sej.

Konklusion

Næsten alle S. suis-isolater var følsomme for penicillin, og der kunne ikke påvises nogen ændring heri over tid. Penicillin bør derfor være førstevalg ved behandling af S. suis-infektioner. En stor andel isolater var resistente overfor tetracyklin i hele perioden 2004-2019. En stigende tendens i retning af en højere andel med høje MIC-værdier sås derimod for især erythromycin (makrolider), men også tiamulin og trimethoprim. Sådanne ændringer over tid fremhæver vigtigheden af en kontinuerlig overvågning af resistens og eventuel justering af behandlingsvejledningerne ud fra et prudent use-synspunkt. Undersøgelsen understreger også behovet for at få standardiserede protokoller for resistenstest samt fastlagt anerkendte kliniske breakpoints for at skelne mellem klinisk følsomme og resistente. Hertil er der behov for at få fastlagt ECOFFs samt tilvejebringe farmakokinetiske data.

Acknowledgements

Teknisk personale på Veterinærinstituttet og SEGES Laboratorium for Svinesygdomme takkes for uvurderlig laboratorieassistance. Undersøgelsen er blevet støttet med midler fra Fødevarestyrelsen.