Endofytter er svampe, der symptomfrit inficerer græsser. Som udgangspunkt er de ikke patogene, da planten ikke ødelægges af endofytterne, og planten og endofytterne lever i symbiotisk tilstand. Endofytterne får beskyttelse og næring fra planten, og via planten kan endofytterne spredes til andre planter. Samtidig danner endofytterne hyfer og sporer, der udskiller stoffer med gavnlig effekt på planten, der beskyttes mod insektangreb, ligesom endofytterne gør planten mere tørkeresistent [1; 2]. Denne effekt udnyttes af producenter af frøgræsblandinger, der tilsætter endofytter som biologisk bekæmpelse, særligt til græsplæneblandinger, men også til fodergræsblandinger [3]. Desværre kan endofytterne producere mykotoksiner i høje koncentrationer, som under de rette klimatiske betingelser medfører alvorlige forgiftninger af husdyr.
Overordnet findes tre primære mykotoksikoser, hvor indtagelse af endofytinficerede græsser kan medføre forgiftningssymptomer hos drøvtyggere og heste [4].
- Meldrøjeforgiftning (ergotisme) skyldes forgiftning med et ergot alkaloid, produceret af svampen Claviceps purpurea, der makroskopisk kan visualiseres som sorte aflange »frø« på græssernes frøhoved. Symptomerne er kendetegnet ved halthed, gangræn i ekstremiteter, såsom klove/hove, hale, ører og lemmer, forårsaget af spasmer i arterier, der herved reducerer blodforsyningen til de berørte områder [5].
- Svingelforgiftning (fescue toxicosis) opstår, når bl.a. græsarten Strandsvingel (Festuca arundinacea) (Figur 1) inficeres med endofytsvampen Epichloë coenophialum (tidligere kaldet Acremonium coenephialum og Neotyphodium coenophialum), der producerer ergovaliner. Endofytten er dog også fundet i almindelig rajgræs og andre græsarter. Modsat meldrøjeforgiftning kan endofytterne ikke erkendes makroskopisk, men mycelier og hyfer kan visualiseres i mikroskop. Symptomerne varierer og ses enten som nedsat mælkeydelse, vægttab, hypersalivation (fescue toxicosis) eller gangræn i distale lemmer, ører, hale (fescue foot) [6]. Slutteligt er forgiftninger, der resulterer i ødemer i bl.a. hoved og lemmer, også beskrevet (fescue-associated oedema) [7].
- Rajgræsslingren (Ryegrass staggers) skyldes forgiftning med mykotoksinet Lolitrem B, der produceres af endofytten Epichloë lolii (tidligere kaldet Neotyphodium lolii), som især findes i almindelig rajgræs (Lolium perenne) (Figur 1). Endofytsvampene kan ikke erkendes makroskopisk. Symptomerne er primært neurologiske, hvor især slingerhed dominerer,[8] og forgiftningen beskrives detaljeret nedenfor.
Rajgræsslingren (Ryegrass staggers)
Endofytsvampen Epichloë lolii inficerer almindelig rajgræs (Lolium perenne), og i denne symbiose produceres flere mykotoksiner, som fx alkaloidet Lolitrem B og i mindre grad også mykotoksiner som Paxillin, Peramin og Ergovalin [9]. Lolitrem B binder til og deaktiverer calcium-aktiverede kaliumkanaler, hvorved muskelfascikulationer og senere kramper udvikles [10].
Udbrud af rajgræsslingren er ofte karakteriseret ved muskelfascikulationer (muskeltremor), ataksi, at dyret svajer, når det står stille, og evt. udvikles kramper og kollaps, som forværres ved motion. Symptomerne er blevet rapporteret i får, geder, kvæg, heste, æsler, rådyr og alpaca, der har gået på græs med frøgræsser eller indtaget frøgræshalm inficeret med svampen Epichloë lolii [9].
Udover neurologiske symptomer er også fald i mælkeydelse, vægttab, diarré samt generel utrivelighed rapporteret. Da Epichloë lolii også producerer andre mykotoksiner som fx Ergovalin, er symptomer, som beskrevet under Svingelforgiftning, også rapporteret efter indtagelse af mykotoksiner produceret af Epichloë lolii. Særligt i Australien og New Zealand er sygdommen udbredt, og udbrud er hyppigst registreret om sommeren [8].
Figur 1. Billeder af strandsvingel (Festuca arundinacea) t.v. og almindelig rajgræs (Lollium perenne) t.h., som kan inficeres med endofytter.
Mængden af produceret mykotoksin afhænger af flere forhold, hvor bl.a. varme og tørre somre øger risikoen for øget produktion af mykotoksiner, ligesom plantens vækstbetingelser samt genotype spiller ind. Derfor er der stor variation i mængden af mykotoksin mellem årene, også indenfor den enkelte mark [11].
Som nævnt tidligere tilsættes endofytter til visse fodergræsblandinger, men svampene findes også naturligt i frøgræsser, der vokser vildt på fx enge og overdrev, hvor der er fundet endofytinfektionsprocenter nogle steder i Danmark på mellem 50 og 80 %.[12] Både Ergovalin og Lolitrem B forbliver aktive i tørret hø og wrap, hvorfor forgiftningssymptomer også ses hos dyr udelukkende fodret med fx frøgræshalm [9].
For forfatterne af denne artikel var svampeendofytter og forgiftninger heraf ny viden, og formålet med nærværende artikel var derfor at beskrive et sygdomsudbrud i tre hestebesætninger på Amager og henlede opmærksomheden på de kliniske symptomer, der udvikles efter indtagelse af disse mykotoksiner.
Præsentation af patienter
Universitetshospitalet for Store Husdyr kontaktedes en eftermiddag i august måned 2021 af en rideskoleejer på Amager, idet flere af hestene var blevet slingre. Symptomerne opstod få timer efter hestene var lukket ind fra fold, hvor de iøvrigt havde gået på græs hele sommeren uden sygdomstegn. Dyrene blev fodret med frøgræshalm fra en kommerciel leverandør samt lidt kraftfoder. De fik tildelt drikkevand på folden fra et badekar, som dagligt blev fyldt op.
Klinisk undersøgelse
Alle besætningens 16 heste (12 vallaker og 4 hopper i alderen 5 til 37 år, heraf 5 fjordheste, 2 haflingere, 2 tinkere, 1 connemara, 1 pinto og 5 blandingsracer) blev underkastet fuld klinisk undersøgelse inklusive neurologisk undersøgelse. Ligeledes blev der udtaget blod- og gødningsprøver, samt næsesvaber fra alle heste. Tolv af de 16 heste havde neurologiske symptomer, som uddybes nedenfor.
Hestene var velplejede og i normal/let overvægtig huld. Generelt var hestene ængstelige og hypereksiterbare, og flere svajede både frem og tilbage og fra side til side, når de stod overladt til sig selv. Ædelysten varierede mellem dyrene fra ingen til normal ædelyst, og enkelte heste udviste polydipsi. Der blev afsat normal fæces hos størsteparten, men nogle havde tilsmudset bagpart og diarré.
Ingen af hestene havde feber, men flere havde let takykardi (puls 44-52 slag/min). Slimhinder var normale af farve og fugtighed med normal kapillærfyldningstid. Luftveje, hjerte og mavetarmkanal var i øvrigt uden anmærkninger. Ved de neurologiske undersøgelser fandtes normal symmetri og følsomhed i ansigt samt på kroppen. Fem ud af 12 heste med neurologiske symptomer havde nedsat/ophørt trusselrespons. Tungetonus og synkerefleks var normal hos alle undtagen en hest, hvor tungen hang slapt ud af munden, og hesten savlede. Hos en hest sås udtalte muskelfascikulationer i ansigtsmuskulaturen og på forparten.
Bevægelighed af hals (gulerodstesten) var normal hos alle dyr, og der var normal hudsensorium på kroppen, og dyrene reagerede ved tråd i kronrand. To heste havde slap hale og nedsat perinealrefleks. Ved mønstring af hestene i skridt bevægede alle heste sig nødigt og gik med bredt stillede bagben og udtalt ataksi. Når hestene stoppede op efter mønstring, svajede de markant. Alle heste trådte normalt tilbage og flyttede både for- og bagben korrekt ved mønstring i cirkler. Flere udviste svaghed ved træk i halen under mønstring i skridt, og nogle sank sammen på bagparten. Ved blindfoldning af hestene mistede flere balancen, selv når de stod helt stille.
På baggrund af de indledende undersøgelser opstilledes en neurologiske problemliste karakteriseret ved udtalt ataksi, slingerhed, manglende balance (kraftig forværring ved blindfoldning) og ængstelighed/hypereksitabilitet. For nogle af hestene endvidere nedsat trusselrespons, slap hale, slap tunge og muskelfascikulationer. Sekundært fandtes også et mavetarmproblem karakteriseret ved diarré.
Behandling
Selvom årsagen til symptomerne ikke var identificeret, blev de 12 heste med neurologiske symptomer indledningsvist behandlet med dexametason (Dexadreson® Vet) 0,05 mg/kg iv samt Di-tri-octahedral smectite (Bio-SpongeTM ) 3-400 g afhængigt af hestens størrelse iblandet 5 l vand indgivet med ventrikelsonde. Di-tri-octahedral smectite har toxinbindende effekt, hvorfor dette skal indgives hurtigst muligt for at opnå effekt. Til efterbehandling blev der udleveret meloxicam (Metacam®) 0,6 mg/kg po en gang dagligt i tre dage.
Differentialdiagnoser
På baggrund af de kliniske fund blev følgende differentialdiagnoser overvejet:
Virus
Herpesvirus (EHV-1) kan give ataksi, slap hale, evt. feber og afficering af hjernenerverne. Særligt en hest havde symptomer på West Nile Virus (Flaviviridae), hvor de udtalte muskelfascikulationer i ansigtsmuskulatur og på forparten samt tydelig temperamentsændring kunne pege på denne sygdom. Denne sygdom er anmeldepligtig Liste-1, men da kun en hest udviste disse symptomer, besluttedes det i samråd med Fødevarestyrelsen ikke at udtage prøvemateriale herfor.
Indtagelse af toksiske stoffer
Ved gennemgang af marken fandtes flere potentielt giftige planter (Figur 2), men ingen af de fundne planter optrådte i stort antal. Amarant (Amaranthus) er beskrevet som giftig for især drøvtyggere og heste, men der kræves indtag af store mængder, før eventuelle forgiftningssymptomer optræder. Klinisk ses bl.a. neurologiske symptomer som ataksi, diarré og paralyse. Ved indtagelse af planten akkumuleres nitrat, som bl.a. giver myokarditis og nyreskader resulterende i øget kalium og fosfor i dyrenes blod.
Figur 2. Planter indsamlet på marken, hvor de første 12 heste havde gået på græs.
Efterfølgende analyse af blodprøver viste normale elektrolyt- og nyreværdier, hvorfor det ikke var sandsynligt, at dyrene var blevet forgiftet herfra.
Bittersød natskygge (Solanum dulcamara) er særdeles giftig for heste, men dyrene indtager kun planten, hvis der ikke er andet spiseligt på folden. Forgiftningssymptomerne fremkommer som følge af toksinet solanin, hvor symptomer som anorexi, dilaterede pupiller, lysfølsomhed, nervøsitet, muskelfascikulationer, forstoppelse eller diarré, desorientering og ataksi er beskrevet.
Symptomer, der var forenelige med de kliniske fund hos hestene, men da der på marken kun var observeret en enkelt plante, og der iøvrigt var rigeligt stråfoder til hestene, ansås det ikke for sandsynligt, at denne plante havde forårsaget symptomerne.
Prikbladet perikon (Hypericum perforatum) kan efter indtagelse resultere i primær fotosensibilisering uden leverbeskadigelse med hudnekrose af ikke pigmenterede områder. Da forgiftning med perikon kun i sjældne tilfælde resulterer i neurologiske symptomer, udelukkedes denne plante som årsag til de kliniske symptomer.
Mykotoksiner og pesticider
En lang række mykotoksiner og pesticider kan give neurologiske symptomer hos heste, svin, kvæg og små drøvtyggere. Da det tildelte frøgræs var visuelt af god kvalitet, blev det i første omgang ikke vurderet som relevant. Som artiklen lægger op til, skulle det vise sig ikke at være korrekt vurderet.
Kunne giftige stoffer i vandet være årsag til symptomerne?
Da de berørte heste alle havde fået vand separat fra de øvrige marker omkring, mistænktes initielt forgiftning af vand som udløsende årsag. Med henblik på at få foretaget analyser af vandet, blev Giftlinjen kontaktet telefonisk for råd og vejledning. De vurderede, at politiet burde kontaktes, da det ikke kunne afvises, at vandet forsætligt var forgiftet, hvorfor både hestene såvel som borgere i området kunne være eksponeret for giftstoffer. Herefter tog casen en drejning fra primært at skulle håndtere 12 meget syge dyr til også at skulle forholde sig til adskillige betjente, der løbende afhørte alle berørte, finkæmmede området, indsamlede diverse bevismateriale og fik kortlagt situationen.
Udtagelse af diagnostiske prøver
Med henblik på diagnostik af EHV-1 blev næsesvaber samt blodprøve udtaget. Derudover blev der udtaget blodprøver (hæmatologisk og biokemisk profil) samt foder-, vand- og fæcesprøver. Blodprøver og næsesvaber blev analyseret for de fem heste med de sværeste kliniske symptomer.
Resultater af prøverne viste, at hestene ikke havde EHV-1, og der fandtes ingen påvirkning af muskel-, lever- eller nyreværdier. Blodprøverne blev desværre først udtaget mellem 1 og 2 timer efter dexametasonbehandlingen, hvorfor leukocytose med neutrofili samt forøget total plasmaprotein blev observeret, som naturligt respons på dette. Da akutfaseproteinerne serum amyloid A (SAA) samt fibrinogen var normale, understøttede dette vores formodning om, at leukocytose og neutrofili var induceret af dexametasonbehandling og ikke skyldtes aktiv inflammation i hestene.
Da politiet efter gennemgang af sagen vurderede, at der ikke var tale om forsætlig forgiftning af drikkevandet, blev vandet ikke undersøgt yderligere.
| Lolitrem B (ppm) | Referenceværdi (ppm)[1; 13] | Ergovalin (ppm) | Referenceværdi (ppm)[1; 13] | |
| Frøgræs | 6,03 | Hest: Ukendt Kvæg: 1.8-2.0 Får: 1,8-2.0 |
2,45 | Hest: 0,3-0,5 Kvæg: 0,5-0,8 Får: 0,5-0,8 |
Tabel 1. Koncentrationer af mykotoksinerne Lolitrem B og Ergovalin i frøgræs indsendt til analyse. Resultaterne er angivet som middelværdien af 3 delprøver udtaget fra det indleverede plantemateriale efter frysetørring og formaling.
Frøgræshalmen blev dagen efter besætningens sygdomsudbrud undersøgt for 560 forskellige pesticider, samt de »traditionelle« mykotoksiner, såsom Aflatoxin og Zearalenon. Her blev der fundet rester af Fluroxypyr (ukrudtsmiddel), Tebuconazol (svampemiddel) og Trinexapac (vækstreguleringsmiddel), alle tre stammende fra tilladte og hyppigt anvendte sprøjtemidler til frøgræs (analyser foretaget af Agrolab Lufa Gmbh, Kiel på foranledning af Agrovi, Hillerød). Eftersom koncentrationerne var relativt lave (0,12-0,52 mg/kg), og ingen af de tre nævnte pesticider er beskrevet at give tilsvarende neurologiske symptomer, vurderedes det, at disse ikke kunne have resulteret i de kliniske symptomer hos hestene. Derfor blev frøgræshalmen efterfølgende sendt til Danmarks Jordbrugsforskning, Afdeling for Plantebiologi, Forskningscenter Flakkebjerg i Slagelse med henblik på analyser for svampeendofytter og disses mykotoksiner. Koncentrationer af både Lolitrem B og Ergovalin var langt over grænseværdierne, der er beskrevet at give kliniske symptomer (Tabel 1).
Opfølgning på hestene
Alt frøgræshalm på marken samt vandet i drikkekaret blev fjernet fra dyrene, og wrap blev istedet tildelt. Hestene bedredes langsomt over de efterfølgende dage, og fem dage efter var alle heste klinisk normale.
Flere slingre heste
Dagen efter kontaktede besætningsejeren Universitetshospitalet igen, idet 4 plage, der gik på en anden mark, nu udviste neurologiske symptomer, som ovenfor beskrevet. Symptomerne var dog mildere, hvorfor vi aftalte at fjerne frøgræshalmen fra marken og observere hestene før evt. behandling, og hestene kom sig uden yderligere behandling.
I dagene efter ovenstående besøg blev Universitetshospitalet kontaktet af to andre besætningsejere med henholdsvis 3 og 4 heste, hvor hestene udviste lignende neurologiske symptomer med slingerhed som det gennemgående kliniske fund. To af hestene havde derudover bradykardi (Puls 24-26 slag/min), men ellers intet at bemærke til den kliniske undersøgelse i øvrigt.
Hestene blev behandlet palliativt, og disse heste bedredes ligeledes klinisk i løbet af nogle dage. Blodprøver viste lymfopeni, men var ellers uden anmærkninger, og EHV-1 kunne ikke påvises. Den ene besætning var nabogård til ovenstående rideskole, mens den anden lå ca. 5 km væk på Amager. Fælles for alle tre besætninger var, at hestene primært gik på fold, og alle fik tildelt frøgræshalm fra samme leverandør. Alle besætningsejerne fjernede frøgræshalmen fra hestene.
Diskussion
De neurologiske forgiftningssymptomer præsenteret i denne caseserie er i klar overensstemmelse med de kliniske symptomer på rajgræsslingren beskrevet ved kliniske cases og eksperimentelle studier af heste og drøvtyggere forgiftet med mykotoksiner produceret af endofytsvampen Epichloë lolii [8; 9]. Karakteristisk for hestene i nærværende caseserie var, at hestene svajede, når de stod stille overladt til sig selv, var tydeligt ataktiske ved mønstring i skridt, og at ataksien blev markant forværret ved blindfoldning, hvilket er i overensstemmelse med et tidligere studium, som anfører, at netop disse fund er karakteristiske symptomer ved forgiftning med Lolitrem B [8]. Kun en af de undersøgte heste på Amager udviste muskelfascikulationer i hoved og på forparten, hvilket i andre studier er rapporteret hyppigere forekommende både hos får og heste [8; 9].
Rajgræsslingren er endnu ikke et stort problem i Europa, hvor kasuistikker dominerer frem for store sygdomsudbrud[14-16], men hvis tilsætning af endofytter i kommercielle græsblandinger stiger, må flere udbrud forventes fremover, både via kommercielle græsser, men også på grund af spredning af endofytsvampe til naturlige græsarealer. Derfor vil dyrlæger i Danmark i fremtiden formentlig oftere blive konfronteret med endofytforgiftede drøvtyggere og heste.
Toksinkoncentrationen i foderet kan ikke alene afgøre, hvorvidt dyrene får forgiftningssymptomer, da mængden af foderindtag kan variere og evt. supplering med toksinfrit foder vil fortynde mængden af toksiner indtaget af det enkelte dyr. Et eksperimentelt forsøg, hvor heste tildeltes ad libitum frøgræshalm med en Lolitrem B-koncentration på 2 ppm gav forgiftningssymptomer hos alle forsøgsheste, hvorfor det er sandsynligt, at koncentrationen på 6,03 ppm Lolitrem B i vores analyser har givet forgiftningssymptomer hos hestene, som primært ernæredes af frøgræshalmen. Ergovalin var også markant forhøjet i prøverne udtaget fra Amager, men hestene udviste ikke tegn på forgiftningssymptomer relateret til Ergovalin, hvor hedeslag og hypertermi, gangræn og ødemer er karakteristiske.
Selvom der er angivet maksimale koncentrationer af Lolitrem B og Ergovalin i foder, tyder det på, at selv meget lave koncentrationer af særligt ergovaliner kan føre til mere uspecifikke subkliniske symptomer, hvor bl.a. reproduktionsproblemer (forlænget drægtighed, øget frekvens af dystoki og agalakti) er rapporteret hos heste i USA eller lavere mælkeydelse hos malkekvæg selv ved lave koncentrationer af Ergovalin og Lolitrem B.[17; 18] Både Ergovalin og Lolitrem B forbliver aktive i tørret hø og wrap, omend koncentrationen reduceres [19].
Behandling af forgiftning med Lolitrem B består i at fjerne det forgiftede foder fra dyrene, og derefter aftager symptomerne gradvist. Fjernes det forgiftede foder/græs i tide, overlever dyrene, men hvis dyrene fortsat indtager foderet, kan dødsfald indtræde, hvilket er rapporteret i fåre- og kvægflokke i Australien [9]. Behandling af hestene med det toksinbindende Di-tri-octahedral smectite og de antiinflammatoriske præparater dexametason samt efterfølgende meloxicam havde derfor næppe været nødvendigt, og dyrene ville sandsynligvis være restitueret uden behandling.
Frøgræshalm er et populært strukturfoder til heste og kvæg, særligt hvor der er behov for strukturfoder med lavere energiindhold end i fx hø. Det er dog væsentligt at have dokumentation for indholdet af eventuelle svampeendofytter i frøgræsblandingen, hvilket producenten bør kunne oplyse. Hvis infektionsprocenten er lav (under 10 % i strandsvingel og under 20 % i rajgræs) er der næppe risiko for symptomer, dog anbefales det ikke at fodre følhopper med græsser/frøgræshalm, der indeholder endofytter [17]. Er koncentrationen højere, kan toksicitet evt. udvikles, og foderet bør blandes med andet for at reducere koncentrationen af endofytter eller kasseres. Er der forgiftningssymptomer, kan niveauet af mykotoksiner måles i foderet. Frisk græs eller tørret frøgræshalm kan bl.a. analyseres på Dansk Jordbrugsforskning, Forskningscenter Flakkebjerg [20].
Konklusion
Denne caseserie beskriver forgiftning af 23 heste på Amager efter indtagelse af frøgræshalm inficeret med endofytter producerende mykotoksinet Lolitrem B, hvilket medførte neurologiske symptomer karakteriseret ved, at hestene svajede, samt var tydeligt ataktiske ved mønstring i skridt. Blindfoldning forværrede ataksien markant, og hestene kunne vanskeligt holde balancen, selv når de stod stille. Alle heste restituerede sig fuldstændigt efter fjernelse af frøgræshalmen. Hvorvidt frøgræsset er inficeret med endofytter, kan ikke erkendes med det blotte øje, men endofyt- og mykotoksinkoncentrationerne kan bestemmes ved analyser af foderet.
Tak til dyrlæge Frederikke Sofie Foged, dyrlægestuderende Astrid Klarskov Hansen for assistance ved undersøgelse og behandling af hestene. Agronom Camilla Beck Nielsen og hospitalschef Susanne Nautrup Olsen takkes for kritisk gennemlæsning af manuskriptet. Slutteligt tak til Amagerland Rideskole ved Sara Silke Jacobsen, som har været behjælpelig i forhold til prøveudtagning og opfølgning af hestene.
