I Danmark har man siden 1954 arbejdet med et nationalt program for bekæmpelse af forekomsten af Streptococcus agalactiae (gruppe B-streptokokker - GBS) i mælkeleverende kvægbesætninger. I mange år var programmet baseret på mikrobiologisk undersøgelse med efterfølgende sanering (1). I 1963 blev der indført et decideret overvågnings- og udryddelsesprogram, hvor det aktive og målrettede udryddelsesprogram stoppede i 1995. Beslutningen om at indstille saneringsprogrammet blev truffet, bl.a. fordi man ikke længere mente, det var essentielt for folkesundheden, og samtidig mente man, at det humane reservoir betød, at fuldstændig sanering ikke var muligt.
Indtil 1995 blev der foretaget overvågning på tankniveau med varierende frekvens fra 3-48 måneder kombineret med det aktivt offentligt finansieret udryddelsesprogram. I »Evaluering af det danske Streptococcus agalactiae (GBS) overvågningsprogram af mælkekvægsbesætninger« (2) evaluerede man i 2003 det hidtidige program og kom med en række anbefalinger for det fremtidige program, hvoraf nogle af dem var:
- Der skal også i fremtiden findes et centralt register for GBS-smittede mælkeleverende besætninger
- Handelsbegrænsninger kan hæves, da de kun har ringe betydning for smittespredning
- Nye diagnostiske metoder skal implementeres, hvis muligt, for at få øget sikkerhed og kontinuitet på udpegning af positive besætninger
- Der skal fortsat årligt udtages tankprøver på mælkeleverende besætninger.
Som reaktion på den stadigt stigende prævalens er overvågningsfrekvensen øget til to gange årligt siden 2017, og der er udarbejdet en ny vejledning til bekendtgørelse nr. 225 af 17. marts 2005, der fastsatte regler for overvågning af mastitis.
Den nuværende procedure
Der er fortsat restriktioner for smittede malkekvægsbesætninger, herunder forbud mod, at lakterende køer deltager i dyrskuer og andre samlinger af malkekvæg, samt oplysningspligt overfor alle, der kommer i kontakt med besætningen. Det er også præciseret, at ved indkøb af voksent malkekvæg fra smittebesætninger, kommer man automatisk i registret med GBS-positive besætninger.
Den nuværende procedure for at få fri status igen er fire negative tankprøver med 3045 dages interval eller udtagning af enkeltkirtelprøver på alle lakterende dyr med opfølgning på køer i behandling og goldkøer, efterhånden som de kælver.
Man er gået fra en prævalens på 0,6 % positive besætninger i 1994 (98 mælkeleverende besætninger) til 7,6 % af besætninger i august 2019 (210 mælkeleverende) ud af 2.763 mælkeleverende besætninger i Danmark (3). Fordelingen af smittede besætninger i Danmark kan ses af Figur 1, som samtidig illustrerer fordelingen af malkekøer i Danmark. Der ses tydeligt en koncentration i den vestlige del af landet, hvor størstedelen af mælke leverende besætningerne findes.
 |
Figur 1. Mælkeleverende ejendomme med Gruppe B-streptokokker i Danmark. Fordelingen viser, at forekomsten er højest i den vestlige del af landet, hvor størstedelen af besætningerne findes.
Smitte fra dyr til mennesker og omvendt
Det er velkendt, at visse mikroorganismer kan overføres fra et reservoir hos dyr til mennesker. Når overførslen forårsager infektion hos en smittet person, betegnes sygdommen som en zoonose. Mange zoonoser har været omtalt i pressen de senere år som fx mindre epidemier af fødevare bårne infektioner forårsaget af bakterier fra fjerkræ, svin eller kvæg. Smitte kan undertiden transmitteres den modsatte vej, dvs. fra et reservoir hos mennesker, og så forårsage infektioner hos dyr. Sådanne sygdomme betegnes undertiden antroponoser (fra græsk: anthrópos = menneske, nosos = sygdom).
Bekæmpelse af zoonoser (bl.a. Salmonella) er afgørende for fødevare sikkerheden og har på mange områder været succesfuld de senere år, fx ved fjerkræ. Tilsvarende kan forebyggelse af antroponoser måske reducere økonomiske tab i den animalske produktion. Forståelsen af overførslen af patogener mellem dyr, mennesker og miljø er derfor vigtig, men det kan imidlertid være vanskeligt at udforske samspillet, idet sygdomme hos mennesker og dyr ofte undersøges i separate studier. Prøveindsamlingen kan derfor bliver skæv grundet fysiske, tidsmæssige eller geografiske barrierer, hvilket kan føre til forkerte konklusioner.
Vi har i en årrække interesseret os netop for GBS, der også kan forvolde infektioner hos mennesker. Som nævnt ovenfor er GBS en hyppig årsag til yverbetændelse (mastitis) hos kvæg. Hos mennesker er det specielt hos nyfødte, GBS kan forårsage alvorlige infektioner såsom lungebetændelse (pneumoni), blodforgiftning (sepsis) og hjernehindebetændelse (meningitis), der kan have et fatalt forløb. GBS er også en del af normalfloraen i tarmen og undertiden i svælget samt i skeden hos kvinder.
Hos voksne giver bakterien meget sjældent anledning til infektioner, selvom der i de senere år er rapporteret en stigning i antallet af GBS-infektioner hos ældre. Vi har tidligere vist, at omkring en tredjedel af alle gravide kvinder er bærere af GBS under deres graviditet og et år efter, de har født (4). Formentlig er lige så stor en andel af mænd som kvinder asymptomatiske bærere af GBS, hvilket vores seneste studie også viser (5).
Figur 2. Gruppe B-streptokokker i mælk fra mastitiskøer. De tre viste agarplader er tilsået på overfladen med 0,1 mL frisk ubehandlet mælk udtaget fra tre forskellige køer med yverbetændelse. Agar-pladerne (ChromID® Strepto B – Biomerieux diagnostics) har en diameter på 9 cm. Når GBS vokser på pladerne (37°C i 18 timer) danner hver enkel af disse bakterier en rød koloni. Antallet af røde kolonier viser således mængden af GBS, der udskilles med mælken. Pladerne er fotograferet fra oven, og billedet er spejlvendt, således at skriften på bagsiden nemmere kan læses. Numrene angiver gård nr. 5, ko nr. 16, 24 og 25, mælkeprøve (m).
For at opnå en bedre forståelse af smittespredningen af GBS har vi gennemført en grundig undersøgelse af otte GBS-positive besætninger (5). I denne meddelelse vil vi kort redegøre for vores resultater. Vi undersøgte, om GBS udviser værtsspecificitet, eller om bakterierne spredes mellem personalet og kvæg på de enkelte gårde. Prøveindsamlingen har vi optimeret ved at undersøge forekomsten af GBS hos de to værter – menneske og kvæg – side om side i det samme studie. Der blev foretaget omhyggelig prøveindsamling fra hvert individ bestående af svælg-, rektal- og vaginalprøver fra mennesker, samt rektal-, vaginal- og mælkeprøver fra kvæg. I mindre omfang blev der udtaget prøver fra staldinventar (malkerobotter, filtre mv.).
For at undersøge udbredelse, spredningen og smitteveje (epidemiologi) for GBS er det nødvendigt at kunne inddele bakteriestammerne i beslægtede grupper. Den første metode til inddeling var baseret på serologi, hvor man påviser forskellige polysakkarid-antigener ved hjælp af diagnostiske antistoffer fremstillet i kaniner. GBS kan inddeles i 10 serotyper (Ia, Ib og II – IX). Senere blev DNA-baserede teknikker som PFGE (pulsed-field gel electrophoresis) og MLST (multilocus sequence typing) benyttet. Disse metoder har haft stor betydning for forståelsen af infektioner forårsaget af GBS og mange andre bakterier. PFGE og MLST er arbejdstunge teknikker, og man opnår kun en delvis karakterisering af bakterierne.
Figur 3. Skematisk fremstilling af, hvorledes forskellige udviklingslinjer af gruppe B-streptokokker kan opstå fra en fælles stamfar, når spontane mutationer i kromosomet og overførte genetiske elementer (vist som farvede punkter) videregives (nedarves) til næste generation. Figuren viser desuden to kloner af helt ens stammer (blå klon B2 og rød klon C2), mens der er genetisk forskel mellem de øvrige stammer i den sidste generation.
I dag benyttes fuld genomsekvensering i stigende omfang, da denne metode giver meget mere præcise og komplette oplysninger om hver stamme, idet hele den genetiske kode i hvert kromosom aflæses. Metoden er mindre arbejds krævende end de ovennævnte, idet man kan få selve sekvenseringen udført af private firmaer. Prisen har her været faldende de senere år,
men fuld genomsekvensering er stadig relativt bekostelig (ca. 1.000 kr. pr. stamme i 2019), derfor er antallet af stammer, vi har inkluderet i vores studie, begrænset.
Genom-data analyseres ved hjælp at specialiserede computerprogrammer, og resultaterne kan sendes og sammenlignes med data fra andre laboratorier. Bakterier vokser ved ukønnet formering. De enkelte bakteriestammer udvikler sig fra en fælles stamfar - dels ved spontane mutationer i genmaterialet, dels ved overførsel af genelementer mellem forskellige bakterier (horisontal genoverførsel). De erhvervede genetiske forskelle nedarves fra en generation til den næste ved vertikal genoverførsel som vist på Figur 3. Det er netop på basis af genforskelle (og ligheder), at slægtsskab mellem de forskellige udviklingslinjer kan fastlægges som vist i figur 4.
Figur 4. Diagrammet afspejler det indbyrdes slægtskab (fylogenetisk træ) mellem GBS-stammer, der er isoleret fra ansatte og kvæg på forskellige danske kvægbedrifter. De otte gårde (A-D) er markeret med symboler og i forskellige farver. Hver GBSstamme er vist med en farve og et stammenummer, der angiver: Gård (A-D), vært (kvæg, K, eller personale, P), nummer (fx person 1, P1, og ko 1, K1), prøve (mælk, m; rektal, R; svælg, S og vagina, V). Ud for stammenumrene er desuden vist symboler for deres oprindelse. GBS-stammerne vist i grupper, hvor de stammer, der er tættest beslægtet, er vist i lodret rækkefølge. Den samlede vandrette afstand alene viser forskellen mellem stammerne (den lodrette afstand medtages ikke). Dybe forgreninger viser således store forskelle, mens manglende forgrening mellem to stammer viser, at de er helt ens. Som eksempel er vist afstanden mellem stammen D-P3-S og stammen A-P4-R som summen af de viste linjestykker 1-5. De to stammer i eksemplet er således meget forskellige, da de har stor afstand. I modsætning hertil er de 10 øverste stammer meget ens, da der ingen forgreninger af betydning ses mellem dem. Disse stammer udgør som vist en såkaldt klon, dvs. en gruppe af stammer med samme oprindelse (se teksten for yderligere forklaring). For at gøre meddelelsen mere læsevenlig er der anført nye stammenumre i forhold til originalarbejdet (5).
Undersøgelsesmetode
I det følgende gives et kort resumé over de metoder, der blev anvendt i vores seneste arbejde. Interesserede henvises til den detaljerede beskrivelse i originalartiklen (5). Der blev indsamlet mere end 800 prøver fra 243 køer og fra 42 ansatte ved 8 forskellige danske malkekvægs besætninger. Vi isolerede 105 GBS-stammer fra prøverne. PFGE (se ovenfor) blev benyttet til en grovinddeling af de fundne GBS-stammer.
På basis af de indledende resultater blev 25 GBS-stammer udvalgt til yderligere analyse ved fuld genomsekvensering. De 25 genomer blev sammenlignet indbyrdes og desuden sammenlignet med GBS-genomer, der var hentet fra en international database (GenBank, ncbi. nlm.nih.gov/genbank). Vi valgte kun at sammenligne de danske GBS-stammer med GBS- stammer med oprindelse i Italien. I modsætning til andre lande kunne vi finde genomer af GBS-stammer isoleret fra både kvæg og mennesker i Italien. Derfor blev netop dette land valgt til sammenligningen.
Udover de genetiske analyser blev de danske GBS-stammer også undersøgt ved hjælp af klassiske mikrobiologiske metoder, bl.a. forgæring af mælkesukker (laktose) og ved serotypning. Genomsekvenser blev som nævnt analyseret og sammenlignet ved hjælp af forskellige computerprogrammer. På basis af beregningerne blev slægtsskabet mellem stammerne fastlagt.
Resultater
Forekomsten af GBS var højere blandt personalet (48 % bærere) end blandt kvæget (21 % inficeret) på de 8 undersøgte gårde (5). Overraskende var 14 % af de ansatte koloniseret med GBS i svælget, hvilket formentlig skyldes, at der drikkes frisk ubehandlet mælk på gårdene. Vi fandt således, at køer med yverbetændelse udskiller store mængder GBS i mælken - fra 1.000 til flere end 1.000.000 bakterier (CFU) pr. mL som vist på Figur 2.
Syv køer (2-3 %) var koloniseret uden for yveret (rektalt og/eller vaginalt), hvilket viser, at nogle dyr kan optræde som asymptomatisk bærer af GBS. Vi fandt desuden, at ansatte og kvæg på de individuelle gårde ofte er koloniseret med helt den samme stamme (klon) af GBS. Eksempelvis blev den samme GBS-stamme fundet hos tre personer og hos fem køer på gård A, som vist på Figur 4. Denne stamme blev desuden fundet på gård B og C. Disse ens stammer udgør en enkelt klon med samme oprindelse (Figur 4 øverst).
På yderligere tre gårde (E, F og G) blev der ligeledes påvist ens GBS-stammer hos kvæg og ansatte (Figur 4).
Resultatet af undersøgelserne viser klart, at der sker smittespredning mellem kvæget og personalet i det tætte miljø i besætningerne, og at bakterierne ikke udviser værtsspecificitet. Ved at sammenligne med GBS-stammer fra Italien kunne vi desuden vise, at de fælles GBS-stammer formentlig har human oprindelse (data er ikke vist her). Det er således sandsynligt, at smitten på de enkelte gårde indledningsvis findes hos personalet, der dernæst smitter besætningen.
Figur 5. Mulige smitteveje for GBS i kvægbesætninger. Den røde farve viser personer og kvæg smittet med GBS i besætning A. Hvis dyr sælges fra besætning A til den rene besætning B, eller hvis en ansat fra gård A får arbejde på gård B, er der risiko for smittespredning af bakterierne. Risiko for smitte fra personale til kvæg er størst, hvis den ansatte er bærer af en gruppe B-streptokok (GBS), der kan udnytte laktose (lak+).
Resumé og anbefalinger
Resultaterne sandsynliggør således, at smittet med gruppe B streptokokker kan overføres både af kvæg og af personale, som vist på Figur 5. Risiko for smitteoverførsel til kvæget er størst, hvis en ansat er bærer af en laktoseforgærende gruppe B streptokok (lak+ GBS), og hvis der desuden er svigt i hygiejnen.
Smitte mellem de enkelte dyr i en besætning kan dels ske ved at dyr med yverbetændelse udskiller bakterierne med mælken, dels ved at en del dyr er rektalt koloniseret med gruppe B streptokokker, hvor ved der udskilles GBS i afføringen. Ansatte kan blive smitte ved kontakt med dyrene og desuden ved indtagelse af kontamineret mælk.
På basis af vores undersøgelser vil vi fremsætte følgende anbefalinger:
Ved besætningsundersøgelser, hvor man vil identificere smittevejen: Det anbefales at isolere og karakterisere GBS- stammerne. Det optimale er fuld genomsekvensering af udvalgte bakterieisolater.
Ved rektal eller vaginal undersøgelse af dyr: Der skal altid anvendes sterilt engangsudstyr og kun til et dyr.
Der bør anvendes samme procedure vedrørende intern og ekstern smittebeskyttelse som i besætninger smittet med Salmonella enterica Dublin.
Vi takker de landmænd, der har deltaget i projektet, for deres hjælp og støtte til gennemførelse af undersøgelserne og forskningslaborant Herdis Berg Johansen for hendes store og dygtige indsats i forbindelse med laboratorieundersøgelserne. Samtidig vil vi gerne takke Promilleafgiftfonden for økonomisk støtte til gennemførelse af projektet.
