| *Artiklen er skrevet på baggrund af et speciale, der er udarbejdet på Københavns Universitet i samarbejde med lektor Arshnee Moodley, postdoc Dziuginta Jasinskyte og dyrlæge Henrik Larsen. Specialet er en del af projektet »Alternativ og effektiv biosanering af Streptococcus uberis mastitis«, støttet af Mælkeafgiftfonden. |
Bovin mastitis forårsager økonomiske og velfærdsmæssige problemer på malkekvægsbesætninger i hele verden (1). I den moderne produktionsform arbejdes der kontinuerligt på at øge køernes mælkeydelse, hvilket gør køerne mere udsatte for intramammære infektioner. I flere lande ses antallet af mastitis-tilfælde stigende (2,3).
Antibiotika er i årtier blevet brugt til at behandle og kontrollere mastitis, men kontrol af Streptococcus uberis (S. uberis) er fortsat en udfordring for både dyrlæger og landmænd. Bakterien er svær at bekæmpe, da den findes overalt i køerne miljø (4) og ofte forårsager re-infektioner og kroniske tilfælde (5). Det øger risikoen for resistensudvikling, og det er en potentiel smittekilde
for mennesker (6,7).
Som respons indfører flere lande antibiotikarestriktioner i landbruget, men der er behov for udvikling af alternative produktionssystemer, samt nye strategier for infektionsforebyggelse for at undgå dårligere dyrevelfærd samt økonomiske tab i dyreproduktionen.
I vores projekt har vi har arbejdet på at finde bakteriofager (fager), som potentielt kan bruges til at forebygge S. uberis-mastitis som et alternativ, der kan bidrage til at
reducere antibiotikaforbruget i danske malkekvægsbesætninger.
Virus som alternativ til antibiotika
Fager er virus, der er specialiseret i at dræbe bakterier og ikke eukaryote celler. Der findes to forskellige typer; en virulent type (lytiske fager) samt en avirulent type (temperate eller lysogene fager). Begge typer adsorberer til overfladen af bakterier og injicerer deres genmateriale ind i cellen. Virulente fager indgår herefter i en lytisk cyklus, hvor bakteriens replikationssystem anvendes til at producere nye fager fra produktionen af virale proteiner og nukleinsyrer. Ved udskillelse af bl.a. lysin frigives fag-afkom, idet bakteriens cellemembran ødelægges (8).
I modsætning til de virulente fager indgår nogle temperate fager i en lytisk cyklus og andre en lysogen cyklus. Lysogene celler er bakterier, der modstår invasionen af fager ved at integrere fagens DNA i sit eget genom, og derved forårsager fagen ingen skade på bakterien. Disse lysogene bakterieceller, som indeholder fag-genmaterieale (kaldet profager), kan blive induceret til at indgå i en lytisk cyklus ved påvirkning af stressorer som fx UV-lys eller andre ændringer i omkringliggende miljø, og herved kan fagerne igen gøre skade på bakterien og frigive nye fag-afkom (9,10). Se figur 1.
Fager blev opdaget allerede i 1915 (11) og brugt til at behandle forskellige sygdomme hos mennesker (12). Men ved opdagelsen af penicillin og andre antimikrobielle midler blev brugen af fager henlagt, da antibiotika var langt mere bredspektret samt nemmere og billigere at producere. I dag er der stor interesse for anvendelse af alternativer som fager, da udvikling og spredning af resistente bakterier, samt restriktioner på brugen af antibiotika i landbruget er stigende i hele verden.
Fager har vist sig at have flere fordele sammenlignet med antibiotika: 1) Hver fagtype rammer oftest kun bakterier af specifik species eller stamme, hvilket kun har lav eller ingen påvirkning af lokale mikrobiomer, fx i tarmen ved oralt indtag (13,14). 2) Det er blevet påvist, at nogle typer kan nedbryde biofilm (15), og 3) genoprette følsomhed overfor antimikrobielle stoer (16). 4) Til dato er der kun opdaget milde til ingen bivirkninger, når et fag-produkt er blevet testet som terapi (17).
Selve projektet
Projektets formål var at isolere og karakterisere fager, der kunne lysere S. uberis under laboratorieforhold. Det vil potentielt være et skridt på vejen til at producere en fag-cocktail, som kan sprayes ud i staldmiljøet og derved forebygge S. uberis-infektioner. En effektiv forebyggelse vil på længere sigt kunne øge yversundheden hos køer og på den måde sænke celletallet i tankmælken. Det vil kunne reducere forbruget af antibiotika, øge dyrevelfærden og potentielt skabe økonomiske fordele for landmanden.
Fra seks forskellige malkekvægsbesætninger i Midtjylland indsamlede vi miljøprøver som fæces og strøelse, samt mælkeprøver fra køer med og uden kliniske symptomer. Efterfølgende opformerede vi prøverne i laboratoriet og testede dem mod 75 S. uberis-stammer med dobbeltlags agar-metoden (figur 2). Det er en slags screeningsundersøgelse, der kan finde fager med evne til at dræbe en eller flere undertyper af S. uberis.
Figur 1. Fagers replikationscyklus fra "The future of bacteriophage" (10).
Fund af 13 aktive fager
Dyrkningen resulterede i et fund af 13 fager, der var aktive mod en eller flere af de testede S. uberis-stammer. I høje koncentrationer, op til 109 Plaques Forming Units (PFU) pr. ml, lyserede alle fager minimum 11 forskellige S. uberis-stammer, men effektiviteten af fager blev væsentlig reduceret ved lavere koncentrationer (fra 102-105 PFU/ml). For nærmere karakterisering af fagerne blev de typebestemt ved indsendelse af ekstraheret DNA til fuldgenom-sekventering på Institut for Veterinær- og Husdyrvidenskab. Resultatet af den bioinformatoriske analyse viste, at fagerne kunne opdeles i to grupper, hvoraf de enkelte fager inden for hver gruppe var stort set identiske. Alle fagerne var unikke ved sammenligning med databasen, men det var muligt at identificere integrase gener, hvilket indikerer, at alle fagerne var af den avirulente type.
Vores forskning opdagede derfor ingen super-fag, der direkte kan bruges som desinfektionsmiddel af staldmiljøet. Men undersøgelserne bidrager til indsigt og forståelse af S. uberis-fagernes biologi og kan anvendes til planlægning og design af fremtidige og relaterede studier. Nye spørgsmål skal besvares, som fx: Kan avirulente fager aktiveres eller genmodificeres, således at de kan blive mere effektive? Hele studiet er med til at øge fokus på resistente bakterier og alternative bekæmpelsesmetoder.
Kort om S. uberis-yverbetændelse
Af de mange forskellige mastitis-patogener, som findes i malkekvægsbesætninger, er S. uberis en af de vigtigste miljøassocierede bakterier i mange lande (18–22). S. uberis forekommer de fleste steder i køernes miljø, og netop mange re-infektioner forekommer i besætningerne, da køerne kontinuert bliver eksponeret for bakterien i det strøelse og madrasser, som de ligger i. Køerne er især udsat kort tid efter malkning, da pattekanalen her er mere åben (23).
Hyppig forekomst af mastitis i en besætning resulterer i et forhøjet celletal (SCC) i tankmælken. Det kan medføre store økonomisk tab for landmænd, idet mælkepriser falder ved niveauer over 300.000 SCC. Desuden skal mælk fra køer, der behandles med antibiotika, malkes fra, og i flere tilfælde må køer med re- og kroniske infektioner aflives eller sendes til slagt.
Antibiotikaresistens hos S. uberis
Som et sideprojekt testede vi alle vores S. uberis-stammer (n=75) for resistens mod syv forskellige antibiotika. Forudgående blev alle S. uberis-stammer identificeret vha. Maldi Tof (MS). Resistensbestemmelse blev udført via disk-diffusionsmetoden (24), hvor vi anvendte Müller Hinton Agar med 5 % kalveblod iblandet. De anvendte antibiotika blev udvalgt på baggrund den danske behandlingsvejledning (25), samt ud fra The Clinical & Laboratory Standards Institute guidelines (26). Antibiotika, som indgik i forsøget var: Penicillin G, Penicillin/Novobiocin, Ceftiofur, Cefalexin, Pirlimycin, Tetracyclin, Cloxacillin (tabel 1).
Resultatet af forsøget viste 6,7 % resistens mod Pirlimycin og 26,7 % mod Tetracyclin. Alle S. uberis-stammer var følsomme overfor de testede beta-lactamer, hvilket indikerer, at de stadig er effektive – så længe det varer - til behandlingen af S. uberis-infektioner.
Tabel 1. Grænseværdier anvendt ud fra CLSI-guidelines samt EUCAST.
Hot forskningsområde
Forskning indenfor fager og deres lytiske proteiner er blevet udbredt i hele verden. Forskere har opstillet kliniske forsøg med brug af musemodeller (17,27) og brugt fager som terapi til mennesker (28). Men på det euro-amerikanske marked findes i dag ingen kommercielle lægemidler til brug mod humane infektioner. Det skyldes især komplicerede regulatoriske procedurer, som alle produkter skal bestå for at blive godkendt. I modsætning hertil er produkter succesfuldt udviklet og anvendt i fx fødevareindustrien, hvor fager effektivt anvendes som desinfektionsmidler og til konservering af fødevarer (29,30). Andre anvendelser er set i forbindelse med udvikling af diagnostiske redskaber til detektering af patogene bakterier (31).
Indenfor veterinærmedicin samt aquakultur er fager blevet fundet effektive mod mange forskellige patogener, herunder bl.a. E. coli, Salmonella spp. og Campylobacter spp. til behandling af produktionsdyr som fjerkræ, kalve, slagtesvin og mink (32–36) samt patogener hos fisk og skaldyr (37,38). Der ses også forskning, hvor hunde med kronisk otitis forårsaget af Pseudomonas aeruginosa er behandlet med fager (27), samt effektiv behandling mod methicillin-resistente Staphylococcus pseudointermedius i hudinfektioner (39).
Til forebyggelse og behandling af mastitis hos malkekvæg er fokus især lagt på bekæmpelse af S. aureus og E. coli. Studier viser varierende succes med behandling, og forskere vurderer, at i flere tilfælde bliver fagerne enten nedbrudt af immunforsvaret i yveret (40), eller at koncentrationen af fager, som gives intramammært, ikke er tilstrækkelig (41,42). Til dato er kun få studier publiceret på baggrund af S. uberis-fager, og med dette studie håber vi at være med til at øge fokus på at bekæmpe smitten i staldmiljøet – netop som en effektiv forebyggelse, der kan gavne dyr og mennesker.
Artiklen er opdateret 9. marts 2020 med information om, at specialet er en del af projektet »Alternativ og effektiv biosanering af Streptococcus uberis mastitis«, støttet af Mælkeafgiftfonden.
